自身抗体检测|抗核抗体检测(ANA)

2020-10-21 11:04| 编辑: 归去来兮| 查看: 4135| 评论: 0|来源: 体外诊断技术支持 | 作者：Fernn Cheung

摘要: 抗核抗体(anti-nuclear antibody , ANA)是自身免疫性疾病患者血清中最常出现的一类自身抗体，ANA检测对于自身免疫性疾病的诊断具有重要意义。ANA传统上是指抗细胞核抗原成分(包括DNA、RNA、蛋白或这些物质的分子复合 ...

抗核抗体(anti-nuclear antibody , ANA)是自身免疫性疾病患者血清中最常出现的一类自身抗体，ANA检测对于自身免疫性疾病的诊断具有重要意义。ANA传统上是指抗细胞核抗原成分(包括DNA、RNA、蛋白或这些物质的分子复合物)的自身抗体的总称。近年来ANA的概念有所扩大，是指抗真核细胞所有抗原成分(包括核酸、核蛋白、细胞骨架及胞质成分等)的自身抗体，抗体主要为IgG，也包括IgA、IgM、IgD和IgE，它们可与不同种属来源细胞的相应抗原成分发生反应。ANA主要存在于血液中，也可存在于胸水和关节滑膜液等体液中。ANA检测是许多自身免疫病诊断的首选筛查项目。

1.间接免疫荧光法

【原理】待测标本中的ANA与细胞底物片(如HEp-2细胞)的相应抗原发生抗原-抗体特异性反应，用缓冲液洗去未结合物，然后滴加荧光素标记的抗人免疫球蛋白抗体(又称抗抗体或二抗，通常为抗IgG抗体)，荧光二抗与底物细胞已结合的抗原-抗体复合物上的抗体分子再特异性结合，形成抗原-抗体-荧光二抗的免疫复合物，冲洗除去未结合的荧光二抗后，将底物片置于荧光显微镜下观察。在细胞底物片上，形成抗原-抗体-荧光二抗复合物的部位显示特异性荧光，提示待测标本中存在针对细胞相关抗原的自身抗体，即ANA阳性。

【试剂组成】细胞片、荧光素标记的抗人IgG、阳性和阴性对照、PBS吐温缓冲液和封片介质等配套试剂。

【结果判定】

(1)阴性:荧光显微镜下观察细胞片，仅见模糊、暗泼的非特异性荧光。

(2)可疑:即cut- off 值检测结果，荧光显微镜下细胞片产生一定强度的荧光，但无法辨别荧光模型。

(3 )阳性:荧光显微镜下可见明亮、清晰的细胞荧光着色，并可于HEp-2 细胞底物片中辨别荧光模型。目前可识别的荧光模型有20多种，常见的荧光模型有:

①均质型(homogenous,H): 即整个细胞核呈现均匀荧光，分裂期细胞染色体有荧光。

②颗粒型(speckled，S):又称斑点型，细胞核内染色质呈现颗粒状或藕孔状荧光。分裂期细胞染色体无荧光，可见“口形”状暗影。

③周边型(rim):又称核膜( membranous)型，细胞核的周边呈现荧光环，或在均一的荧光背景上核周边荧光增强，此模型在猴肝基质片中较HEp-2细胞更加明显。分裂期细胞浓缩染色体阴性。

④核仁型(nucleolar,N):荧光着染在核仁区，分裂期细胞染色体无荧光着色。

⑤着丝点型(centromere):在非分裂期HEp-2细胞的细胞核内散在分布相同大小的颗粒荧光(46-92个不等),在有丝分裂期，荧光颗粒聚集在细胞中板或位于两侧呈带状排列;在灵长类肝组织切片，可观察到分布于细胞核的10- 20个颗粒，分裂期细胞则少见；与HEp-2细胞相比较，肝组织片的荧光相当弱，容易被忽略导至假阴性结果。

⑥混合型:兼有两种或以上的荧光染色模型，提示该患者有多种自身抗体同时存在。

(4)抗体阳性的滴度检测:当标本起始稀释倍数检测结果为阳性时，应采用相应的稀释程序进一步检测，直至稀释到检测结果为阴性的前一稀释度，即为该抗体的滴度值。常用的血清稀释度为1:100、1:320、1:1000、1:3200或1:80、1:160、1:320、1:640倍比稀释，稀释度越高表明ANA滴度越高，即抗体浓度越高。

正常人血清ANA为阴性。

2.ELISA 法

【原理】取HEp-2细胞粗抗原或纯化抗原的混合抗原包被ELISA板，即形成有结合能力的固相抗原，加入待测标本，标本中的ANA与固相抗原特异性结合，形成抗原-ANA复合物，洗去未结合物，然后加人酶标记的抗人免疫球蛋白抗体(又称二抗或抗抗体，通常为抗IgG抗体)，该抗体与已和固相抗原结合的抗原-抗体复合物上的抗体分子再特异性结合，洗涤去除过量的未结合酶标二抗，加人底物，酶催化生成显色产物，显色深洗与标本中ANA浓度成正比。依据ANA标准品制作标准曲线即可进行ANA定量检测。

【试剂组成】包被ANA相关抗原的微孔板、酶标记二抗、酶底物溶液、阴性对照、阳性对照、标本稀释液和浓缩洗涤液等。

【结果判定】

(1)定性检测:显色程度低于cut-off值为阴性，若高于cut-off值则为阳性。

(2)定量试验:以吸光度为纵坐标，标准品浓度为横坐标制作标准曲线，根据待测标本吸光度查得ANA浓度。

正常人血清ANA定性试验通常为阴性。定量试验各实验室应建立自己的参考区间。如用文献或说明书提供的参考区间，使用前应加以验证。

【临床意义】

美国风湿病学会将ANA作为SLE的诊断标准之一，其阳性率大于95%，阴性可基本排除SLE，故ANA检测常作为SLE的首选筛查试验。但ANA并不是SLE的特异性自身抗体。在其他自身免疫性疾病，如MCTD，ANA检出率可达95%-100%;干燥综合征(SS)为70%-80%;进行性系统性硬化(progressive systemic sclerosis, PSS)检出率可达85%-95%；药物性狼疮、类风湿关节炎、多发性肌炎及皮肌炎、慢性活动性肝炎等也有20%-50%的检出率。因此不能仅以ANA阳性，作为某种自身免疫病的诊断依据，还必须进行与疾病相关的自身抗体检测来辅助临床诊断。

由于ANA是抗含有真核细胞所有抗原成分的自身抗体，间接免疫荧光法检测ANA可获得许多自身抗体的荧光模型信息，不同的荧光模型可为临床医生提供更多的临床指导信息。如均质型荧光模型与抗组蛋白抗体、抗dsDNA抗体和抗核小体抗体有关，主要见于SLE和药物性狼疮等患者；颗粒型荧光模型与抗UIRNP、抗Sm、抗SSA和抗SSB等多种核蛋白抗体相关，主要见于MCTD、SLE和SS等自身免疫性疾病患者；周边型荧光模型主要与抗板层素、抗核孔复合体(gp210、p62)等抗体有关，主要见于PBC和自身免疫性肝炎；核仁型荧光模型与抗RNA多聚酶I抗体、抗纤维蛋白抗体、抗PM-Scl抗体与抗Scl-70抗体等有关，主要见于进行性系统性硬化症，也可见于雷诺病和SLE；着丝点型荧光模型主要与抗着丝粒蛋白B有关，其与局限型硬化症及SLE等相关；混合荧光模型对应的自身抗体更为复杂，这种荧光模型对临床疾病诊断的指导价值有限。

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