进样器堵了,离子源脏了,柱压又高了!每次遇到这种问题打电话给工程师,总要接受灵魂拷问:你用什么样本做的?前处理方法是什么?Blabla一番后,最后的结论总是你的样本太脏了,再优化下前处理吧! 临床生化检验常用的生物样本包括血清、血浆、尿液、唾液和各种组织等,这类样本含有大量的蛋白质,无机盐和磷脂等杂质。对于质谱分析来说,这类样本都是比较 “脏”的,在进行分析前需要进行前处理除去杂质以保证质谱分析的灵敏度和获得高准确度的结果。 生物样本前处理又称为样本净化,样本制备等,主要是指将一个或多个待测目标分析物从复杂的生物基质中有选择性地分离提取出来并使其达到一定水平的分析浓度,以满足和适应仪器的分析和检测要求。在临床质谱分析中,样本前处理占整体分析时间的60%左右。 生物样本前处理的目的是:
常用的生物样本前处理技术有蛋白沉淀法,液液萃取法,固相萃取法以及衍生化法等。 在正常情况下,由于水化层和表面两性电荷存在,在溶液中的蛋白质是稳定的分散体系,不会凝集。通过改变溶液的环境(改变pH值,介电常数和离子强度等),使蛋白质变性,降低其溶解度,最终使蛋白质凝聚而从溶液中析出。 常用的蛋白沉淀法有以下几种:
(Liquid-Liquid Extraction,LLE) 利用待测目标物在两种不混溶的液体之间的溶解度或分配比不同,将其从一相中提取至另一相的溶剂中而实现分离的目的。LLE通常一相为水相,另一相则是有机溶剂,亲水性化合物倾向溶于极性强的水相,而疏水化合物则倾向溶于有机溶剂中。该方法可以较好地去除干扰物质和纯化待测目标物。通过氮吹,冷冻干燥等方式可以轻松浓缩待测目标物。 (Supported liquid extraction,SLE) 采用高比表面积的化学惰性物质(使用分级硅藻土)固定。当含水量高的生物体液样本上样后,样本被吸附于硅藻土的微孔结构内, 在硅藻土微孔的表面形成一层薄薄的液膜。当加入与水不互溶的洗脱溶剂后,洗脱溶剂进入微孔内, 与水相液膜间进行微观液液萃取,待测物被洗脱溶剂萃取出来,而磷脂、蛋白等杂质则会吸附在硅藻土的极性表面上,从而达到萃取-净化效果。 (Solidphaseextraction,SPE) 基本原理与液相色谱相似。根据待测化合物和杂质在SPE柱上的分配系数不同,通过加入不同的洗脱溶剂分别将杂质与待测化合物分离,从而纯化待测化合物。 SPE洗脱有两种方式: 一、杂质吸附保留在柱子上,而待测化合物在柱子上不保留自然流出,或用洗脱剂先洗脱下来; 二、待测化合物吸附保留在柱子上,杂质先被洗脱下来,最后再将待测化合物洗脱下来。 是指利用化学反应将难以检测或者不稳定的待测目标物定量转化成类似的可被分析检测或稳定的衍生化合物,通过测定衍生化合物含量而间接对待测目标物进行定量。对于质量数小的目标化合物,通过衍生化反应可增大目标化合物的质量数,提高分析的准确度。另外,衍生化法可提高离子化的效率,增加检测的灵敏度。
除以上常用的样本前处理方式外,近年发展起来的样本前处理技术还有液相微萃取、在线固相萃取、免疫亲和等方法,目前也有部分的厂家在研发生物样本前处理自动化的设备。随着技术的发展,生物样本前处理技术正一步步往简单化和自动化的方向发展。相信在不久的将来,临床质谱实验室将会实现前处理-分析-出具报告全过程自动化,从整体上提高质谱分析的效率,减少质谱分析的误差,降低质谱分析的人力成本和时间成本,让质谱更好地服务于临床! 参考文献: [1] 张君仁,臧恒昌.体内药物分析.北京:化学工业出版社,2002. [2] 王思合,程雅婷等.临床色谱质谱检验技术.北京:人民卫生出版社,2017年. [3] 陈晓华,汪群杰.固相萃取技术与应用.北京:科学出版社,2009. |