立即注册找回密码

QQ登录

只需一步,快速开始

微信登录

微信扫一扫,快速登录

手机动态码快速登录

手机号快速注册登录

搜索
小桔灯网 门户 资讯中心 液体活检 查看内容

液体活检新技术在临床肿瘤诊疗中的应用新进展

2020-7-2 00:00| 编辑: 小桔灯网| 查看: 5959| 评论: 0|来源: 中华检验医学杂志丨作者:王砚春

摘要: 肿瘤的诊断与治疗,离不开肿瘤相关分子的检测。液体活体检查(液体活检)是在体液中检测肿瘤相关分子的技术方法,作为临床检验新技术正逐步推广应用。由于传统的组织活检存在创伤性和取材限 ...




作者:王砚春 卢仁泉 郭林


肿瘤的诊断与治疗,离不开肿瘤相关分子的检测。液体活体检查(液体活检)是在体液中检测肿瘤相关分子的技术方法,作为临床检验新技术正逐步推广应用。由于传统的组织活检存在创伤性和取材限制,液体活检作为一种便捷、非侵入性的检测方法,可多次取材、实时反映肿瘤异质性的变化,将为肿瘤的个体化诊疗提供有力依据。

传统的肿瘤标志物多为循环体液中的肿瘤相关蛋白。除了前列腺特异抗原等少部分具有组织器官特异性的肿瘤蛋白外[1],大部分蛋白类肿瘤标志物的特异性不高[2]。这些基于免疫学方法检测的蛋白质,无法获取真正起源于肿瘤的遗传信息,不能从本质上区分肿瘤或正常细胞的分泌来源。因此,针对肿瘤特异性遗传物质的检测才备受关注。

随着检测技术的发展,辨别并量化这些体液中微量的肿瘤遗传物质正得以实现,检测灵敏度也在不断提升。肿瘤基因特定突变的定性与定量检测,成为了液体活检的主体,从技术上囊括了:荧光定量PCR(realtime quantitative PCR)、突变扩增阻滞PCR(amplification refractory mutationsystemPCR,ARMS-PCR)、微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)、磁珠乳液扩增式数字PCR(bead emulsion amplification magneticdigital PCR,BEAMing dPCR)、二代测序(next-generationsequencing,NGS)、杂交芯片等核酸检测技术。此外,富集并捕获肿瘤相关分子后进行特定蛋白检测,也是液体活检的组成部分。

技术的发展使得可检测的分子越来越丰富,液体活检的内容也在不断更新。根据检测的肿瘤相关遗传物质的不同,目前的液体活检检测对象涵盖了循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)、细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)和循环肿瘤RNA(circulatingtumor RNA,ctRNA)等[3];已有相关试剂及检测平台获得监管部门的批准并应用临床(见表1)。基于这些组分的液体活检可以获得:反映恶性肿瘤存在的定性信息;反映肿瘤负荷的定量信息;反映肿瘤异质性的基因组、转录组、蛋白质组等定质信息;为肿瘤诊断、靶向药物使用以及预后分析提供有力依据。下面就液体活检在肿瘤临床检测中的应用进展进行阐述。

表1 已获临床准入的液体活检核酸检测技术

一、循环肿瘤细胞


CTCs是指脱离原发肿瘤,可在循环体液中检测到的肿瘤细胞。CTCs的存在是肿瘤血行转移的基础。因此,CTCs计数可以作为肿瘤的定性与定量依据,具有预后价值。

早期,美国FDA曾批准CellSearch CTCs定量检测系统,用于监测转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌的预后。当乳腺癌和前列腺癌≥5、结直肠癌≥3 CTCs/7.5 mL血液时,患者的总生存期(overall survival,OS)与无进展生存期(progression-free survival,PFS)显著降低[4]

这项技术秉持了传统组织活检的思路,以形态学与表面标志为主要诊断依据,如何结合核酸分子等特异性鉴定,全面获取肿瘤细胞的携带信息、避免干细胞假阳性污染、提高捕获效率与诊断性能,是CTCs检测重返市场所需攻克的难关。

近年来,采用叶酸受体免疫磁珠负向筛选联合靶向荧光定量PCR方法(国械注准20163400061),从一定程度上填补了上述CellSearch CTCs的检测缺陷,能够定量检测人全血中叶酸受体阳性的肿瘤细胞,可用于早期肺癌的辅助诊断以及非小细胞肺癌患者的疗效监测[5]
 
随着单细胞核酸检测技术的发展,对CTCs进行基因突变、表观遗传、RNA转录等定性定量检测也有所报道。例如,结直肠癌患者血液中捕获的CTCs能够检出KRAS、BRAF、磷脂酰肌醇3激酶催化亚单位α(phosphatidylinositol3 kinase catalytic subunit α,PIK3CA)等突变[6]。同时,质谱与芯片技术的发展也可以实现多位点极微量的单细胞蛋白质分析[7]。此外,通过免疫荧光检测CTCs所携带的HER2、表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)等蛋白分子,同时结合荧光原位杂交和定量PCR技术进行基因水平分析,可以提供临床有关治疗靶点的全面信息[8]。但是,肿瘤异质性会带来单细胞检测时检测对象的随机选择;靶向的极度稀少的CTCs,其自身信息能否真实反映肿瘤组织的全貌,这是仅凭CTCs分析不可回避的问题。

二、循环肿瘤DNA


ctDNA是指循环游离DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA)中起源于肿瘤细胞的片段,大小一般在80~200 bp之间。ctDNA作为肿瘤标志物反映全身肿瘤状态的应用,最早来自于胰腺癌血浆KRAS突变的鉴定[9]。之后,ctDNA的诊断、预后、监测价值也被不断揭示[10]。针对肿瘤的突变位点与对应的靶向药物敏感性,能够指导临床制定最有效的治疗方案(见表2)。

表2 可用于指导靶向药物使用的液体活检技术

2016年美国FDA批准了基于ctDNA的伴随诊断试剂,Cobas EGFR突变检测(表1表2[11]。采用荧光PCR的方法,能够发现血浆ctDNA中的19外显子缺失和21外显子L858R敏感突变、以及20外显子T790M敏感突变,分别指导非小细胞肺癌患者对厄洛替尼、奥希替尼等EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)的使用。最新批准的PIK3CA突变检测试剂盒(表1表2),可以检测乳腺癌患者血浆和石蜡组织的11种PIK3CA基因突变,指导敏感突变患者使用PIQRAY®(alpelisib)等药物的治疗。

此外,ctDNA的甲基化水平也可用于肿瘤的诊断。FDA批准的血浆SEPT9基因甲基化检测(表1),可作为结直肠癌的筛选试验,其诊断灵敏度在75%~81%、特异性高达96%~99%[12]。在我国,CFDA批准了SHOX2、RASSF1A基因甲基化检测(表1),通过肺泡灌洗术获取可溶性渗出物,用于早期肺癌的辅助诊断。

这些批准的ctDNA突变或甲基化检测,都是基于荧光定量PCR的方法,其检测灵敏度有限。近来,结合数字PCR等方法,液体活检的检测灵敏度有大幅提升,检测丰度一般可达0.01%[13]。Coren等评估了ddPCR方法检测18种常见肿瘤相关突变的最低检测限,其中EGFR L858R和T790M突变的检测下限分别可达0.0006%和0.008%[14]

此外,测序方法的应用大大提高了检测通量并能发现更多潜在的肿瘤变异。我国CFDA最新批准的"人类BRCA1基因和BRCA2基因突变检测试剂盒"(表1表2),通过卵巢癌患者外周血NGS检测,能够同时发现BRCA1和BRCA2基因全区域的各种突变,全面指导聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)抑制剂奥拉帕利的临床用药,延长BRCA突变阳性患者的无进展生存期[15]。在甲基化检测方面,基于CpG位点捕获的高通量测序方法,在肝癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌中均表现出潜在应用价值[16]。最近,基于cfDNA全基因组测序发现,起源于肿瘤的ctDNA存在片段图谱的特征性改变,这为未知肿瘤的筛查监测提供了一种新的分析方法[17]

但是,临床上仍有约16%~45%的晚期肿瘤患者,即使采用ddPCR和NGS等高灵敏度高通量方法,也未能从ctDNA中发现肿瘤基因的突变[18]。从液体活检的技术上分析,这可能是由于引物设计以及生物信息分析数据库的差强人意,捕捉到的已知肿瘤片段与理想的肿瘤全景图还相去甚远;同时,不同分析平台设置的临界值差异,对基因组污染、扩增子错配的识别以及对结果的注释不尽相同,溯源比较存在偏倚。因此,开发兼顾成本与临床应用的标准化组合,弥补国内参比数据库的短板,确立恰当的临界值,ctDNA活检技术还需紧密联系临床、持续改进。

三、细胞外囊泡


EVs是细胞在各种生理病理条件下释放的膜状颗粒,可作为细胞间信息传递的载体,主要包括10~100 nm大小的外泌体(exosome)和100~1000 nm的微囊泡[19]。EVs中同时包裹了稳定存在的大片段DNA、RNA和蛋白质,能获得肿瘤来源的定性定量定质信息。与侧重于计数和形态鉴定的CTCs检测相比,EVs的分析更关注于核酸及蛋白组分的定质信息。

尽管临床上尚无批准的EVs液体活检试剂,但其转化研究正蓬勃开展。其中,应用研究最为深入的是RNA组分,主要包括:信使RNAs(messenger RNAs,mRNAs)、长非编码RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)、微小RNAs(microRNAs,miRNAs或miRs)和嵌合体RNA等。以结直肠癌为例,针对EVs中的KRAS(12、13、61密码子)和BRAF(600密码子)mRNA突变检测,其灵敏度约为75%、特异度接近100%,与组织检测结果基本一致[20]。结合调控肿瘤基因并特异表达的lncRNAs,从79种大片段RNA中筛选出BCAR4 lncRNA与KRTAP5-4、MAGEA3 mRNAs分子,可用于结直肠癌的诊断,其ROC曲线(receiver operating characteristic curve)的曲线下面积(area under curve,AUC)可达0.936,诊断性能优异[21]。有报道指出,在前列腺癌患者的尿液EVs中,miR-145水平显著升高,对其检测能显著提高前列腺癌的诊断性能[22]。最近研究发现,嵌合体RNA也可作为肿瘤检测的新指标,唾液外泌体中的GOLM1-NAA35 RNA嵌合体水平与食管鳞癌的肿瘤负荷密切相关,能够以此评估放化疗疗效,对无进展生存期具有预后价值[23]

EVs中的蛋白质,也是检测的重要方面。类似于CTCs检测的普适性方法,使用特异抗体捕获含有特定蛋白的EVs,其定量计数对乳腺癌等肿瘤具有早期诊断的能力[24]。EVs蛋白检测的另一优势在于能够通过PD-L1等靶点蛋白检测,筛选出具有免疫抑制功能的黑色素瘤患者,指导抗PD-1的免疫治疗[25]。近年来,基于非小细胞肺癌EVs蛋白质组的质谱分析,筛选出279种血清差异蛋白,通过评估其中纤连蛋白的诊断性能,获得了较理想的结果(AUC=0.833);这种基于EVs蛋白质组筛选肿瘤相关蛋白也是肿瘤诊断研究的可行策略[26]。此外,针对EVs的DNA检测可以作为ctDNA检测的补充,采用ddPCR方法检测EVs中的KRAS突变,亦能用于胰腺癌的预后评估[27]

但是,EVs的分离分析方法种类繁多,标准化操作流程尚未成熟,直接影响临床检测的重复性与溯源性,限制其在临床的应用。2018年,国际细胞外囊泡学会全面更新了EVs的操作指南[28],强调基于得率与纯度选择分离方法的重要性。此外,EVs的检测方法也同样值得注重,以蛋白的免疫荧光检测为例,流式细胞术虽可进行多重标记通量较高,但在灵敏度上不及纳米颗粒追踪分析与全内反射荧光显微镜检测[29]。因此,EVs的分析需要在分离检测的各个环节,根据检测目的与技术条件,确立标准化的最佳检测方案,为临床应用提供技术保障。

四、循环肿瘤RNA


ctRNA是起源于肿瘤的循环游离RNA(circulating cell-free RNA,cfRNA)片段。肿瘤来源的RNA除了携带DNA的遗传突变信息外,也包含了肿瘤相关蛋白的转录表达与调控信息,因此是较为理想的定性定量标志物。但是,相对于EVs中的RNA,ctRNA的半衰期短,不够稳定。因此,不同于EVs中可以检测的大片段RNA,ctRNA的检测对象主要是小片段miRNAs与mRNAs片断。

在我国,CFDA先后批准了基于荧光PCR方法的血清miR-25检测试剂盒(表1)与粪便miR-92a检测试剂盒(表1),分别用于胰腺癌、肠癌的辅助诊断。此外,一项关于miR-21的Meta分析显示,miRNAs检测在食管、胰腺和结直肠癌中均具有预后价值;研究发现miR-21阳性患者的总生存期显著降低,风险比分别为3.46、3.14和3.77[30]

为进一步提高miRNAs的诊断性能,多种miRNAs组合检测方式孕育而生。2017年批准的7种血浆miRNAs检测试剂盒可组合检测miR-21、miR-26a、miR-27a、miR-122、miR-192、miR-223、miR-801,用于动态监测肝癌患者辅助判断疾病进展与治疗效果(表1)。其0.941的AUC、83.2%的灵敏度、93.9%的特异性,大大提升了miRNAs的诊断性能[31]

除了miRNAs,2项针对肿瘤基因转录的mRNAs检测也获得了FDA的批准。在直肠指检(digital rectal examination,DRE)刺激后获取的尿液中,检测PCA3和PSA的mRNA浓度(表1),可用于辅助决策前列腺活检的必要性。当PCA3评分>25时,活检阳性率增高,有必要进行前列腺癌的活检确诊。这一项目拓宽了液体活检在尿液中的应用价值。此外,最新批准的全血BCR-ABL1和ABL1转录检测,适用于表达e13a2/e14a2型BCR-ABL1融合基因的t(9;22)阳性慢性粒细胞白血病患者(表1表2),可通过%IS水平监测TKI治疗的疗效,有助于靶向药物的合理使用。

在技术上,从RNA测序到微流控芯片等高通量分析,ctRNA检测技术不断推陈出新,但不同方法的抽提得率与纯度不尽相同,溯源性与重复性难以保证,ctRNA检测新技术的推广应用还有待临床充分验证。

五、其他检测靶标


除了上述四大类检测靶标外,近年发现的许多新分子也具有潜在应用价值。例如,血小板主动摄取微囊泡后,携带并转运肿瘤特征性的RNA标签,形成了肿瘤教化血小板(Tumor-Educated Platelets,TEPs)。其存在多种特定基因的转录下调或剪接体变异,可能成为一种新的液体活检检测对象[32]。此外,诸如RNA信号复合体(RNA signalatures)等新靶标的发现,相信越来越多的功能分子检测将应用于临床诊疗之中。

六、结语


液体活检技术的迅速发展、检测对象的不断延伸,从CTCs、EVs等有形成分到ctDNA、ctRNA等游离核酸,从个别标志分子到揭示肿瘤异质性的高通量检测,液体活检涵盖了肿瘤特异蛋白到各种核酸组分的全面分析,已有多项液体活检技术批准应用临床,更有许多临床转化研究蓬勃开展。总的来说,可多次取材、动态监测肿瘤状态的液体活检,正逐渐成为临床广泛接受的肿瘤检测新技术。但是,目前的检测还存在着一些瓶颈问题,例如不同检测方法与检测对象的结果一致性等,限制了其在肿瘤诊断、监测、预后中的可比性和溯源性。总之,液体活检是一项极具临床应用前景但仍需不断完善的肿瘤检测技术,相信不久的将来,它将为临床肿瘤诊疗提供更精准、更便捷的方法。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
 

选自中华检验医学杂志, 2019,43(02) 

声明:
1、凡本网注明“来源:小桔灯网”的所有作品,均为本网合法拥有版权或有权使用的作品,转载需联系授权。
2、凡本网注明“来源:XXX(非小桔灯网)”的作品,均转载自其它媒体,转载目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责。其版权归原作者所有,如有侵权请联系删除。
3、所有再转载者需自行获得原作者授权并注明来源。

鲜花

握手

雷人

路过

鸡蛋

最新评论

关闭

官方推荐 上一条 /3 下一条

客服中心 搜索 官方QQ群 洽谈合作
返回顶部