荧光定量PCR vs. 恒温扩增，谁才是分子诊断的未来？

作者：汤明辉

深圳市刚竹医疗科技有限公司

荧光定量PCR 和恒温扩增在分子诊断方面的应用日渐受关注，两种技术孰优孰劣，且听作者娓娓道来。

基于核酸扩增的分子诊断，是通过引物介导特异性扩增目的基因，以检测内源性（遗传或变异）或外源性（病原体）目的基因的存在与否，从而对疾病的诊断和治疗提供信息和决策依据。

其主要应用场景有传染病的诊断，血筛，肿瘤早期辅助诊断，肿瘤的分子分型，遗传病的诊断，产前诊断，组织分型等。其中在传染病的诊断和血筛方面，基于核酸扩增的分子诊断能缩短诊断的“窗口期”，并且可以定量对病原体进行检测。相比于传统的免疫诊断方式而言，有不可替代的优势。

一方面，由于PCR技术的不断成熟，特别是实时荧光定量PCR (qPCR)的出现，使得基于qPCR的分子诊断产品日渐成为主流。

这一块有几个明星产品：赛沛（Cepheid）的GeneXpert PCR分析仪，BioFire的ilmArray，IQuum的cobas Liat PCR System 以及Atlas Genetics的io。这几个明星产品的孵化公司大多被巨头收购。

赛沛在2016年9月被丹纳赫以40亿美元收购；

BioFire在2013年9月被生物梅里埃宣布以4.5亿美元收购；

IQuum 在2014年4月被罗氏以4.5亿美元收购；

英国Atlas Genetics，万孚生物在2016年以约1.25亿人民币获得其14.95%的股权。

竞争激烈和受欢迎程度由此可见一斑。这几款产品均基于微流控的分子诊断产品。另外，我国的博晖创新也于2017年发布了一款基于PCR微流控技术的全自动核酸检测系统。

图1. BioFire的filmArray

另一方面，环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是Notomi等在1998年报道的一种等温核酸扩增技术。

该法依赖于识别保守序列DNA的6个特异性片段的4条引物（2条外引物和2条内引物）和一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）。LAMP检测体系中基因的扩增和产物的检测可一步完成，扩增效率高，可在30～60min扩增 10⁹ ~10¹⁰ 倍，特异性较高。

LAMP技术的主要原理是DNA在65℃左右可以处于动态平衡状态，DNA在此温度下利用4条特异性引物依靠一种链置换DNA聚合酶，使链置换DNA的合成不停地自我循环。基于这一技术的产品包括美艾利尔 i 分子诊断平台，博奥生物的晶芯RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪，百康芯的iChip-400。

图2. 博奥生物的晶芯RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪

本文将重点比较分子诊断中竞争较为激烈的LAMP和实时荧光定量PCR(qPCR)两种技术的优劣。

LAMP只要一个温度（65度左右），相对于qPCR的三个温度的循环，基于LAMP的扩增仪器的温控更容易实现。所以基于LAMP的仪器更简单更便宜，加热耗能更少。

但是另一方面来看，LAMP的引物设计难度高，试剂成本也相应高于qPCR。

图3. qPCR技术需要三个温度的循环

同样由于LAMP只要一个温度（65度左右），相对于qPCR的三个温度的循环，LAMP扩增不需要反复的升温降温过程，所以基于LAMP的扩增速度快于qPCR的扩增速度。LAMP一般可在30～60min扩增 10⁹~10¹⁰ 倍，而qPCR的扩增速度往往取决于扩增仪器加热和冷却的速率。

由于LAMP可以短时间内获得大量的DNA产物，所以可以实现基于浊度的可视化检测。从这个角度上讲，LAMP尤其适用于定性的POCT。

由于LAMP技术一般需要相对较长6个引物，而qPCR只用2个引物，在核酸扩增中只有所有的引物序列都匹配才扩增，所以基于LAMP的核算扩增特异性更强。也就是说，同样条件下LAMP的误扩增的概率更低。

图4. LAMP扩增一般需要6个引物

这一方面，笔者并没有找到有效的数据证据。因为扩增的特异性与引物的设计息息相关，所以并不能简单的比较两个技术的扩增的特异性。基于两对引物的巢氏PCR的出现也大大的增强了qPCR特异性，这里最典型的应用实例就是filmArray。

图5. 使用两对引物的巢氏PCR技术进一步提高了扩增的特异性

案例1:

Zhibing Lin等人的研究表明使用LAMP和qPCR（real-time PCR）分子诊断技术对于弓形虫DNA的检测极限分别是10fg/ul和1fg/ul。常规PCR，LAMP，qPCR检测284只猪和292羊对应检测出的弓形虫阳性比例为：0.4%，3.2%，4.2%和 3.8%，17.1%，17.8% [1]。

案例2:

Guangxiang Wang等人的研究表明在羊的口疮病毒检测中，LAMP正确识别出46只阳性中的41只（89.13%）; qPCR (real-time PCR)正确识别出了46只阳性中的42只(91.30%) [2]。

案例3：

Yi Tang等人的研究表明在坦布苏病毒的检测中，qPCR和LAMP的DNA检测极限分别为：2copies/ul和20copies/ul；RNA检测极限分别为10fg/tube和100fg/tube。检测出来的概率：qPCR和LAMP：82.6%和79.7% [3]。

案例4：

Chapey E.等人的研究表明，在临床弓形虫检测中，有一个病例qPCR检测出来了，LAMP没有检测出来；LAMP检测出来的qPCR均能检测出来；LAMP还有两个病例不确定，qPCR并没有 [4]。

图6. LAMP和qPCR在临床弓形虫检测中的结果对比

总结：以上四组案例均表明，qPCR的检测灵敏度高于LAMP。也就意味着，同样的条件下，qPCR检测的假阴性概率低于LAMP。

LAMP对样品中抑制剂敏感性低于qPCR，这也就意味着LAMP对扩增环境的要求低于qPCR。

众多周知，在实际的产业化中，分子诊断仪器的通量往往至关重要。对于qPCR而言，由于引物设计的成熟和荧光通道的多样性，往往可以比较好的实现高通量检测。我们所熟知的基于多重PCR的filmArray最高一次可以并行检测二十几个指标。

另一方面，由于LAMP的引物需要4-6个（qPCR两个）且LAMP引物一般较长，LAMP的引物设计难于qPCR（虽然有LAMP引物检索网站的协助，但这个问题依然存在）。引物设计困难也导至了LAMP的检测通量受限。

结语：

LAMP虽然很好的解决了PCR的温控难题，但是也相应带来了其他的问题，比如相对于qPCR而言，检测灵敏度不够，引物设计更困难等。这里面最大的问题还是相对于PCR很成熟的技术体系而言，LAMP目前还需要不断的优化和发展。我们也期待着LAMP技术的成长，从而为分子诊断带来更好的产品。

参考文献：

1.  Lin Z, Zhang Y, Zhang H, et al. Comparison of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) and real-time PCR method targeting a 529-bp repeat element for diagnosis of toxoplasmosis[J]. Veterinary parasitology, 2012, 185(2): 296-300.

2.  Wang G, Shang Y, Wang Y, et al. Comparison of a loop-mediated isothermal amplification for orf virus withquantitative real-time PCR[J]. Virology journal, 2013, 10(1): 138.

3.  Tang Y, Yeh Y T, Chen H, et al. Comparison of four molecular assays for the detection of Tembusu virus[J]. Avian Pathology, 2015, 44(5): 379-385.

4.  Chapey E. et al. An evaluation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detected Toxoplasma gondii in clinical specimens.