解密POCT分子诊断产品的试剂制造

自2010年6月第一款核酸POCT检测产品GeneXpert上市以来，七年间，陆续有十几个快速核酸检测产品面市，以图1为例，部分核酸POCT检测产品及上市时间如图所示。

图1 部分核酸POCT产品上市情况

在这些产品逐渐揭开神秘面纱时，作为科研爱好者（研发labor）都不禁会对产品中独具匠心的设计产生兴趣，并努力剖析解密。今天，我们就来扒一扒核酸检测产品中的化学试剂部分是如何存在并成为检测系统中的一员的。

核酸扩增检测试剂包括核酸提取纯化、核酸扩增与检测等几种组分，按成分来说，主要包括引物、探针（带荧光、淬灭基团或电化学检测基团等）、各种酶类、dNTP、增强剂、表面活性剂、盐以及防腐剂等。表面活性剂、盐和引物等小分子化合物只要能够保持在一定湿度、温度条件下，保存不难。但含有标记物的探针和酶类等生物大分子易降解或变性，是试剂能否稳定存在的关键。

从试剂保存形式上来说，大部分核酸POCT试剂卡/盘需要在室温下保存，这就要求化学试剂不能以液态形式存在，必须经过脱水处理，以固体形态存在。使用时，以缓冲液复溶进行后续反应。试剂脱水方式通常有两种，一种是点胶干燥，另一种是冻干珠形式。二者的比较如表1所示，下面谈一下两种形态试剂的生产过程。

表1 试剂干燥方式——点胶干燥与冻干珠比较

1、点胶干燥

点胶干燥（Dry Down）在体外诊断试剂的生产中较常见，比如血糖试纸，就是将微升级反应试剂，含酶和底物等，以加样枪/点样系统加到膜或卡上，以高于室温的温度，如45℃进行烘干。

1.1  制造过程

首先点胶，或称喷墨打印，即将液体用移液器分散到物体表面（通常是PCR反应腔室表面），然后至于烘箱内进行干燥。干燥分为一步法和两步法。一步法指在一个温度下干燥一定时间，两步法指分阶段温度进行干燥。下面以Biocartis公布专利内容解析两步法干燥过程。其专利中提及，先以某一温度T1（<40℃）进行干燥30min，使水等挥发物含量达到10%左右，再以温度T2（>80℃）干燥30min，然后结束干燥过程，最终液体挥发性物质含量<2%。其意义在于，T1温度较低，快速移除绝大部分的可挥发物，而尽可能减少大分子生物的降解。因为失去挥发物后，剩余部分液体变得粘稠，大分子移动性变差，减少了降解的可能。T2温度较高，尽可能地除去残留挥发物。

1.2 试剂组分

为了保证活性损失尽可能小，除核酸检测所必需的试剂外，还可以加入多糖等大分子物质，不仅是赋型剂也是活性保护剂。此外，也应考虑到非挥发类组分对于大分子稳定性的影响，包括无机盐，其在溶液中浓度低影响小，一旦水分等物质挥发掉，无机盐浓度明显升高，可能对大分子的稳定性有影响。以Biocartis一项公开专利中的成分举例，除PCR试剂外，其余组分和组成分别为：海藻糖0.15~0.3M，BSA5.5~6.5mg/ml以及甘油5~15%。

实际开发过程中，先确定PCR试剂组成后，再分别对赋型剂、保护剂以及干燥温度与时间等进行摸索，通过检测PCR产物选定最佳试剂组成。需要特别注意的是，干燥后是否易复溶对实验的影响也较大，理想状态是室温下，干燥试剂快速复溶，不需溶液反复溶解。

1.3 设备要求

点胶干燥的设备主要有移液枪/点样系统和烘箱。通常研发过程中做试剂组分与干燥条件筛选时，不需同时点很多样本，用移液枪即可。制造过程点样为了控制一致性及提高生产效率，需要用到点样系统。点样系统有许多成熟产品供选择，占有率较高的品牌是Biodot，国产品牌较少。

烘箱只要满足一定温度准确度及通风要求即可，根据干燥试剂量等选择相应干燥箱。下图2为相关设备的示例。

图2 点胶干燥相关设备示例

2、冻干珠（Lyo-beads）

2.1 制造过程

制造过程分为三个步骤。第一步混匀各试剂与赋型剂，注意在低温下操作，以保留酶等的生物活性并且按照一定顺序加样，每种试剂完全溶解并混匀后再加下一种试剂。混匀后试剂膜过滤。第二步试剂成型，冻干珠的行成是通过将液滴滴在低温液体中，或滴在低温固体表面以行成其特定形状，如球体。低温液体可以用液氮，沸点低于-150℃。第三步冷冻干燥。利用普通的冻干机可以完成冷冻干燥，需控制压力。干燥过程在于减少生物活性损失，尽量保持原有形态。如果干燥过程过快，活性会有损失。可通过控制压力使缓慢干燥以提高活性。

2.2 试剂组分

类似于点胶干燥体系，冻干珠的试剂配方里除核酸检测试剂必需组成外，还需包括赋型剂和保护剂等物质。

赋型剂通常是惰性物质，包括蔗糖、葡萄糖、海藻糖、松三糖、右旋糖苷和甘露醇，以及聚合物类PEG和PVP等。赋型剂类型影响冻干珠的吸湿性，冻干珠的湿度应达到3%左右。赋型剂量应适当，量少不能成型，量多难复溶。具体多少需实验摸索。保护剂如蛋白类包括BSA、明胶、胶原蛋白等。

核酸POCT检测产品中的赛沛即采用冻干珠形式保存核酸提取与扩增检测试剂。在其一篇公开的专利中提到，冻干珠内含68~75%的甘露醇作为赋型剂，甘露醇可以降低其吸湿性至可接受的范围，并最终获得球体，表面光滑的冻干珠。而海藻糖具有高吸湿性，会导至冻干珠之间的重量不一致，还可能会导至冻干珠之间相融。含水量高的冻干珠内活性损失明显。

2.3 设备要求

冻干珠制造的设备要求明显高于点胶干燥，所需设备包括分液仪器、冻干珠储存装置以及冷冻干燥机。

下图3为分液仪器IVEK Digispense^TM 700system。分别为分液仪器的控制主机（控制分样体积，分样频率等），电机/基底/泵（提供动力，贮存液体），活塞/气缸套（喷射液体）

图3 分液仪器IVEK Digispense 700 system

PCR体系体积一般在5~200μl，冻干珠分装的体积在2-15μl之间，这样它才能在工作溶液5-200μl中溶解。冻干珠子需要浸没在液氮里大概20-30s，在这过程中它会被分隔器分开防止珠子之间融合。

使用专利US20070259348举例说明冻干珠的分装方法和注意事项。图4a表示，当液体滴到疏水处理的容器中时，会形成一个圆形的小球。图4b中502代表分液器的滴头， 508代表液氮进，510表示液氮出。当液氮进出时会使506表面冷冻，形成一定的低温环境，可以使液体滴落后迅速冻干；504突起形成一个个单独的空间，固定小球；这一整个装置控制了板的表面温度，使分液头往下滴液体时不会造成顶端液体凝固，同时能使液体接触表面后能立马凝固。图4c中，220代表该装置的盖子，当处于FIG.3A时，能保持这种没有盖严的状态放入冻干机进行冻干，当冻干结束时可以将盖子压紧（FIG.3B）后，再放到其它房间进行分装。图4d为该分隔器的俯视图。机器控制分液系统是多种的，有很多款分液头，4，8，10，20，24通道，这些全部都是为了能够同时分配液体到在列/横里面。

a                                                        b

c                                                       d

图4冻干液体分装步骤和分隔器

图5为专利US20140294872中的截图，图中整个装置的目的是控制金属板的表面温度使分液头往下滴液体时不会造成顶端液体凝固，同时能使液体接触表面后能立刻凝固。方法与图4的大同小异，图5中的加热层结构为多个散热翅片组成，它的一端接触金属板，一端置于液氮的表面，从而达到降温的效果。

图5 冻干珠在固体表面成型

下图6为专利US8758701B2的冻干珠溶解装置截图。105是有浮力的固定小球与100腔室之间有一个间隙，冻干珠的直径比间隙大，因此不能通过。当液体从106进液口进入腔室，腔室内的空气就会从110排气口排出（排气口为一层膜，只能气体通过，液体不能通过）。一定体积的溶解液体进入腔室后，108冻干珠就会慢慢变成118溶解后变小的冻干珠，最后全部溶解（液体在腔室内孵育一段时间，有可能有加热或者混匀的操作）。此时利用压差，从120通气口通入气体，迫使液体从122通道排出，或者利用重力使液体慢慢流出腔体。图6.B和C也是溶解装置，但不同的构想。图6.B是一个横截面为六边形的固体，它的边缘132与腔室紧密连接，而边缘之间有空隙，液体和气体都可以通过。图6.C是腔体横截面不是圆形的装置，它的上方固定了一个横截面为圆形的小球，这个小球与腔体之间也有空隙，使液体和气体都能通过。

图6 冻干珠溶解装置

产品实现时，究竟用点胶干燥还是冻干珠与试剂卡的设计密切相关。同时，也要考虑制造的难度与成本等。