谈到分子诊断，大部分人想到的方法是聚合酶链式反应PCR。从最初的PCR+终点检测到荧光定量PCR和数字PCR，作为核酸检测最成功的方法，PCR绝对是核酸检测的强大基石。尽管目前基因测序、等温扩增甚至质谱等技术的发展扩宽了分子诊断的应用技术平台，但大部分标志物PCR仍然是检验的金标准。有趣的是，最近几年看到多篇文章采用分子杂交的方法进行DNA或者RNA的检测，特别是目前大热的液体活检，本推送主要探讨分子杂交法核酸检测，以及如何提高其检测灵敏度。
什么是分子杂交
分子杂交（molecular hybridization）是确定单链核酸碱基序列的技术。其基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸（叫做探针）间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。这种技术可在DNA与DNA，RNA与RNA，或DNA与RNA之间进行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同类型的杂交分子。
核酸分子杂交技术作为最基本、最常用的一种分子生物学方法技术，已经普遍应用于生命科学基础研究的各个领域。目前核酸分子杂交技术中几种常用的类型有斑点杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、原位杂交、菌落原位杂交、DNA芯片技术等。除了传统的分子杂交，我认为包括凯杰的杂交捕获、PCR-ELISA、荧光条形码单分子检测技术等都属于分子杂交的技术范畴。关于PCR-ELISA技术可见之后的推送，这种利用ELISA法进行核酸检测或者用PCR方法放大免疫检测的灵敏度是科研上经常使用的方法。
分子杂交与PCR
分子杂交和PCR本质上属于两种分子检测技术。PCR主要起到扩增核酸的目的，分子杂交主要用于检测和确定核酸序列，因此它们其实有不同的应用范围。尽管荧光定量PCR的兴起可以实时监控PCR反应，并最终凭借扩增曲线进行核酸检测，但PCR-杂交法仍然是目前常用的核酸检测方法。
PCR&NGS&分子杂交主要公司代表
与PCR技术和NGS技术相比，杂交的主要优点在于操作简单、可多重检测，其缺点主要在于该方法不能进行序列扩增，因此必须依赖于信号放大技术或者高灵敏的检测设备。
低灵敏度一定不好？
谈到HPV，人们通常想到的检测方法有杂交捕获法、酶切信号放大法、PCR-荧光探针法、转录介导的核酸扩增技术以及PCR-杂交法。这些方法在性能评价上会略有差异，有且仅有杂交捕获法未采用扩增的方式进行检测，且杂交捕获在性能上并不弱于PCR。
从原理上看，HC2经过DNA分解，使用全长探针进行HPV DNA的杂交（这里其实有个蛮有趣的故事，我当初设计探针的时候想当然的用HPV DNA的L1区端进行探针设计，对于这么长的探针找不到相关企业的技术支持，结果性能并不算好），最终使用类似于酶促化学发光的方法进行杂交体的捕获放大。
HC2本质上无须扩增，使用全长探针：8000bps进行HPV的杂交，并且具有统一判定标准（≥1.0pg/ml为阳性，相当于5000拷贝），无类似于PCR的特殊实验要求(人/环境)，并且效率相对于PCR更高，这些都是相对于PCR的优点。但其低灵敏度并没有影响其在HPV，或者宫颈癌的检出效率。
由于宫颈癌筛查涉及面广，故由假阴性和假阳性HPV 检测结果引起的潜在公共卫生损害风险较为显著。假阴性结果可能导至宫颈癌诊断和治疗不及时，假阳性结果可能导至不必要的频繁筛查和侵袭性处置。因此，确立良好的性能指标并充分理解HPV 检测的临床意义，对于此类产品的安全有效性评价至关重要。最关键的是，HPV不同于HIV和HBV等，检测几个拷贝的HPV并没有太大的临床意义。虽然HPV 感染率很高，但其自主清除率也很高，因此对于细胞学检查正常的受试者不建议再采用HPV检测做联合筛查。HC2其实本质上就是解决特异性和灵敏度之间的矛盾，避免疑似病人的过度诊断。
分子杂交一定低灵敏度？
随着技术的不断进步，目前分子杂交正在逐步提高其灵敏度，其中企业界比较出名的有荧光条形码单分子检测技术，科研上研究较热的是纳米技术、电化学技术结合的高灵敏分子杂交。
纳米技术(nanotechnology），也称毫微技术，是研究结构尺寸在1纳米至100纳米范围内材料的性质和应用的一种技术。由于核酸基本属于这个尺度范围，因此纳米技术的发展一定会给目前的核酸诊断技术带来新的技术驱动力。下面这篇文章是我查到较新的使用纳米技术进行高灵敏分子杂交的报道。
该传感器是第一个能够在未加工的血液样本中检测从10 aM到1 nM的microRNA浓度的传感器，这个灵敏度绝对能够和PCR进行对比。具体原理如下：使用磁纳米颗粒修饰的金颗粒作为分散电极进行核酸捕获（由于属于均相反应，效率大大提高），目标核酸与探针杂交后被磁分离。通过基于电场诱导重新配置磁捕获的DNA-Au @ MNP的新方法（称之为连接作为网络组装），可以直接在全血中检测miRNA表达水平，具有高水平的灵敏度和选择性，并具有广泛的动态范围。
目前这种方法被大量应用于液体活检等领域，在科研界属于较热门的话题。感兴趣的可以在WOS上以关键词“hybridization assay”等进行检索。
荧光条形码标记的单分子检测技术是一种全新的高通量检测基因表达谱、miRNA等分子的技术。该技术主要由Nanostring开发，实验原理是设计出捕捉探针和报告探针两种探针，分别与靶mRNA结合。其中捕捉探针标有生物素，用于将杂交复合物固定在cartridge板上；报告探针则带有四色荧光集团，其不同的排列组合方式代表不同的基因。由于需要荧光信号取决于荧光基团的不同排列，背景噪声低，可提高其检测灵敏度。但其本质上也属于纳米科技在杂交捕获上的应用。
关于该技术的详细介绍，可在下面的网址中查看：https://www.queensu.ca/rauhlab/services/nanostring-ncounter-analyzer
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