连环画2 | CRISPR分子诊断技术

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2    细菌也具有先天和获得性两个免疫系统。前者主要包括限制性内切酶/修饰酶，用以破坏入侵病原的遗传物质；后者则主要包括大名鼎鼎的CRISPR-Cas系统。限制性内切酶的发现和广泛使用促进了DNA重组技术的普及，孕育了第一代生物技术公司。而CRISPR技术近几年来迅速崛起，开辟了一个新的时代。

图片来源：参考资料20，http://synergy.st-andrews.ac.uk/crispr/the-crispr-system/

3   与脊椎动物的获得性免疫系统类似，CRISPR-Cas系统也产生“免疫记忆”。按功能区分，Cas蛋白主要有两类：第一类蛋白包括Cas1 和 Cas2， 负责采集入侵的病毒或噬菌体的RNA或DNA，并把它们放入“档案”（CRISPR array），从而产生记忆；第二类蛋白是效应蛋白，比如Cas9，在通过档案产生的特定guide RNA（gRNA)或CRISPR RNA (crRNA)的指导下，识别并切割相匹配的（即存过档的）外源DNA或RNA，从而使再次入侵的病原无法复制。CRISPR-Cas系统涵盖多个家族和多种类型。由于二型系统中只需要单一效应蛋白，这一系统尤其是Cas9酶在基因编辑中被广泛使用。

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4    同其它基因编辑技术相比，CRISPR有很多优势：灵活性（对不同的基因靶点只需改变gRNA序列）、高特异性、便捷性、可模块化、可编程、低成本等等。因此该技术正在医疗、农业和工业等多个领域被广泛开发。在医疗领域中，CRISPR技术的应用主要有三个方向：治疗、科研工具，和体外诊断（IVD）。本文主要讨论CRISPR在体外诊断领域的进展。在该领域中，我们主要利用CRISPR-Cas的识别或“寻找”功能。

5    提起CRISPR，我们就不能不说起两位传奇人物：加州大学（伯克利）的Jennifer Doudna博士，和麻省理工的张锋博士。二者不但在CRISPR技术的发明、应用上做出奠基性的贡献，还积极致力于该技术的产业化和商业化。他们各创立了几家生物技术公司，以开发基因编辑治疗手段。在过去的两年中，Doudna创立的Mammoth Biosciences，和张锋创立的Sherlock Biosciences又先后亮相。与以往不同的是，这两家公司专注于开发以CRISPR为基础的IVD技术。

6    Sherlock和Mammoth两家公司的技术并非横空出世，而是源于张锋和Doudna两家实验室于2015-2018年期间在知名期刊上发表的一系列科研成果。这场学术上的比拼犹如两个武林高手过招，精彩纷呈，让人目不暇接。两个团队互相竞争，也互相学习，开拓了CRISPR分子诊断这一全新领域。

7   几年间，两个团队从产品性能和即时检测可操作性两大维度上不断改进CRISPR诊断技术。产品性能的主要指标包括敏感度、特异性、定量化、检测时间、多重化（通量）、和抗干扰性。即时检测可操作性的主要指标则包括：是否需要复杂的仪器设备和冷链运输、可携带性、简易度、应用广度，和特定诊断手段的开发速度等等。

8   现在让我们重温一下两大门派从2015年到2018年期间在分子诊断领域走过的征程。追踪溯源，2015年10月，张锋团队在Molecular Cell上发表了一篇论文。作者中有张锋的两名博士生Omar Abudayyeh和Jonathan Gootenberg——他们后来成为Sherlock公司的联合创始人。这项研究想要回答的主要问题是：除了目前已发现的两大类五种亚型的CRISPR-Cas系统，还能不能找到新的Cas蛋白或家族？尽管不同系统中的干扰模块中的Cas蛋白差别较大，但采集模块中基本都离不了Cas1和Cas2。他们的思路就是用Cas1的基因去基因库里“钓鱼”，看看能“钓”出什么。

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9   “钓鱼“是在基因库里找cas1基因，再把与cas1相联的基因也一起拽出来。这些基因有可能包括新的CRISPR-Cas系统。经过多轮筛选、验证后，张锋团队发现了三个新的二类系统（效应蛋白为单一蛋白）：C2c1, C2c2, 和C2c3。其中C2c2蛋白后来被重新命名为Cas13a。谁也没有想到，C2c2/Cas13a成为了推动CRISPR诊断技术发展的第一块多米诺骨牌。

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10   在发表于2016年6月的Science论文中，张锋团队又进一步阐述了C2c2/Cas13a的功能和机理。和Cas9类似，C2c2也是单一的效应/干扰蛋白。与Cas9不同的是，C2c2不需要tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA), 而只需要crRNA 的指导。C2c2-crRNA的靶分子也不是DNA，而是入侵病原的单链RNA。最重要的一点是，C2c2-crRNA一旦找到并结合匹配的RNA后，进入激活状态，除了剪切靶RNA外，还大开杀戒，碰到任何单链RNA都可非特异性地将其剪切、降解。但这篇论文并没有把C2c2的特性和诊断技术联系起来。文章的第一、第二作者分别是Abudayyeh和Gootenberg，前文提到的Sherlock Biosciences的联合创始人。

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11   首次将C2c2和分子诊断技术联系起来的是Doudna团队。2016年9月，在Nature发表的一篇论文中，Doudna实验室比较、研究了更多版本的C2c2。这些不同的版本来自于不同的菌类。张锋团队在3个月前的Science论文中主要使用的是LshC2c2，而Doudna团队的主要研究对象则是LbuC2c2。

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12     他们验证了张锋团队的结论：C2c2具有特异性地剪切靶RNA和激活后非特异性地降解其它RNA的功能。他们还发现， C2c2也有将pre-crRNA加工成crRNA的功能。也就是说，C2c2具有双重RNA酶活性。

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13    或许是因为LbuC2c2的特异性和非特异性剪切活性远远高于LshC2c2的相应活性, Doudna团队意识到LbuC2c2可以被用来构建高特异性、高灵敏度的RNA检测方法。若想检测出某一特定序列的RNA分子，先将与其互补的crRNA和LbuC2c2蛋白组装，再加上一些报告RNA分子。常用的一种报告RNA是一段寡核苷酸：一端附有一个荧光素（F），另一端有一个暗淬灭剂（Q）。由于猝灭作用，一个完整的报告RNA分子不会发出荧光。当LbuC2c2-crRNA抓到特定的靶RNA（activating target RNA）时，LbuC2c2的非特异性RNA水解酶的活性被激活，剪切报告RNA，其荧光素摆脱了Q的淬灭，释放出荧光。这样，通过荧光信号就可以检验出靶RNA的存在。Doudna团队用这个方法成功地检测出噬菌体的RNA（右图中的l2, l3和l4），灵敏度达到0.01nM。

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14   C2c2或Cas13a系统的高度特异性取决于Cas13a-crRNA对靶RNA的识别，而高灵敏度则来自激活后的Cas13a的非特异性RNA酶活性——一个被激活的Cas13a分子可以迅速剪切大量报告RNA分子。在没有靶RNA分子的条件下，没有配对成功的Cas13a-crRNA就保持沉默，不会乱砍乱杀。CRISPR分子诊断技术的（剪切式）机理初步建立起来。

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15   这段时间张锋团队也没闲着。他们又用”钓鱼”的方法寻找新的不含Cas1的CRISPR系统。这次他们在基因库里先撒网找到CRISPR array，再把附近的基因一块儿捞上来。他们发现了Cas13b, 另一个靶向RNA的效应/干扰酶。此外，他们还发现了两个辅助蛋白：Csx27和Csx28——前者抑制Cas13b的活性，而后者则加强它的活性。Cas13b的发现为以后设计多重诊断提供了一个额外的工具。这部分结果于2017年1月发表在Molecular Cell上。

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16    仅过了3个月，张锋团队又在Science上发表了一篇里程碑式的论文，标志着CRISPR分子诊断技术的正式建立。他们在Cas13a系统的基础上，又引入了DNA常温扩增技术——RPA，创造了新的技术平台——SHERLOCK技术。待检验的核酸分子，如果是DNA，就先通过RPA扩增，如果是RNA，则通过RT-RPA扩增。扩增后的DNA产物再通过转录变成RNA分子。靶RNA的检测最后通过Cas13a-crRNA和报告RNA来完成。SHERLOCK的名字除了是这一技术的英文缩写外，还暗指传奇侦探夏洛克.福尔摩斯。用SHERLOCK检测特定的核酸分子，就好像福尔摩斯的侦探工作一样，即使是大海捞针的问题，也会迎刃而解。

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17   RPA技术是由英国科学家Niall Armes于2006年发明的。RPA和PCR功能一样，都是指数式扩增DNA分子。但与PCR不同的是，RPA技术不需要经过温度变化的周期。DNA模板双链变单链、引物结合、与延伸合成全都在重组酶、单链结合蛋白等辅助下进行。DNA扩增在一个温度（通常为体温）下即可完成。因此，RPA的一个巨大优势就是不需要特殊的设备，比如PCR仪。RPA技术也被单独应用到分子诊断领域，但因为其灵敏度不如qPCR或digital PCR（ddPCR）高，所以一直没有腾飞——直到张锋团队把它和CRISPR结合起来。

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18  许多诊断应用的灵敏度都需要达到渺摩尔（attomolar, aM或10^-18M）。有了RPA扩增这一步，SHERLOCK检测RNA（左图）或DNA（右图）的灵敏度大大增加，能够测到渺摩尔浓度的靶分子。也就是说，1微升里有一个靶DNA或RNA分子都可以检验出来（10^-18M  x  10^-6L  x  6.02 x 10²³ molecules/mole  <  1 molecule）。实现CRISPR诊断应用的最主要的一个障碍被解除了。除了增加RPA这一步，张锋团队把LshCas13a更换成LwCas13a也对提高灵敏度起到了一定作用。经过进一步摸索，SHERLOCK的所有反应都可以在一个溶液中完成，甚至能将所有试剂变成冻干粉固定在试剂纸上，也不大影响检测的灵敏度。

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19    由于其高灵敏度和特异性，CRISPR诊断技术或CRISPR-Dx可以有很多用途：病毒检测和病毒亚型区分，病菌识别和耐药性基因确认，即时检测（POCT）, 患者基因分型，以及癌症突变分析和液体活检。这篇论文也初步展示了CRISPR-Dx在这些方面的应用前景。

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20   比如，利用SHERLOCK，张锋团队从患者的血清（S）或尿液（U）里检测到浓度低至每微升含单一拷贝的塞卡病毒（ZIKV）。美中不足的是，在用SHERLOCK检测之前，需要从患者的体液样品中提纯病毒RNA，这影响了该方法的便捷性。

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21    SHERLOCK也可被用在癌症液体活检中，从（模拟）患者的游离DNA (cfDNA) 样品中检验出只占0.1%的基因突变（BRAF V600E）。也就是说，SHERLOCK的特异性可达到单碱基分辨度。要想达到如此高的特异性，crRNA的设计很关键。

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22    2017年5月，在张锋团队的Science论文发表不到一个月后，Doudna团队又在Molecular Cell上发表了一篇论文。文中发现所有的Cas13a可以被分为两个亚族。和不同亚族Cas13a配套的crRNA具有不同的辅助序列，激活后Cas13a-crRNA对同一报告RNA的非特异剪切活性也有差别。作为两个亚族的代表，LbaCas13a更易剪切5个A串成的报告RNA，而LbuCas13a偏爱剪切5个U串成的报告RNA。两个Cas13a亚族的区别，使它们可以被用来构建多重高通量诊断分析，即在一次测试中可以同时检验多个靶分子。

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23   2018年2月到4月是CRISPR-Dx技术的爆发期。Doudna实验室和张锋实验室各有一篇论文于2月15日被Science在线发表。在4月27日的纸版的Science中，这两篇论文连同张锋团队的另一篇论文 “back-to-back-to-back”一起发表。在Doudna的Science论文中，他们找到了Cas13a在DNA分子识别、剪切和降解上的相应蛋白——Cas12a。Cas12a不是一个新蛋白，而是张锋团队于2015年9月发现并命名的Cpf1（图8）。

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24   Cas12a-crRNA识别单链或双链DNA。一旦被激活后，Cas12a非特异性地剪切、降解单链DNA。他们借鉴了SHERLOCK技术，也引进了RPA步骤。RPA + Cas12a成为新的核酸分子检验技术，被命名为DETECTR，与英文的“探测器”谐音。与SHERLOCK相比，DETECTR省掉了从扩增后的DNA产物转录到RNA这一步。

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25   DETECTR达到了aM水平的灵敏度和≤7个碱基的特异性。例如，它能准确地检测出受试者携带的是哪种亚型的HPV。

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26   在同期Science论文中，张锋团队从三个方面着手完善SHERLOCK：多重化、定量化和去荧光。先说多重化：他们挑选了来自两个不同菌株的Cas13a和来自两个不同菌株的Cas13b。每个酶的crRNA不同，激活后能剪切的核苷酸对也不相同。这样，在理论上他们可以构建出一个有4个频道的多重分析方法。

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27  在一个实验中，他们通过包括了两个Cas13b, 一个Cas13a，和一个Cas12a的SHERLOCK准确地检验出一个样品是否含有塞卡病毒（ZIKV）的RNA，登革热病毒(DENV)的RNA， 一个靶DNA或一个靶RNA。不同靶分子的信号通过四个不同的荧光频道（FAM, TEX, Cy5和HEX）分别显示出来。

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28   在定量化的方向上，他们发现以前SHERLOCK中RPA一步使用的引物浓度过高，导至DNA扩增跨越了指数线性增长阶段而达到饱和阶段，无法定量测量靶核酸分子。这次他们将引物系列稀释，找到了合适的引物浓度——240nM（中图）。改进后的SHERLOCK在较宽的样品浓度范围内（低至渺摩尔）可持续定量（右图）。

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29   SHERLOCK虽然不需要PCR仪，但由于结果的显示还需要测量荧光信号，它无法真正做到“仪器自由”。这也限制了它在野外、居家、诊所、非医院场所和偏远地区的使用。张锋团队因此尝试开发金标层析格式的SHERLOCK，以通过颜色变化来读取结果。报告RNA两端的荧光素和淬灭剂被分别置换成biotin和FAM。如果报告RNA没有被剪断，金纳米颗粒－FAM抗体－FAM－报告RNA－biotin耦合物就会被strepavidin滞留在第一条线上，第二条线则不显色。如果报告RNA被剪断，金纳米颗粒－FAM抗体－FAM被释放，就能跑到第二条线上，被protein A滞留。所以诊断结果的阳性或阴性可通过第二条线显色或不显色判读。这与验孕棒的使用类似。

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30     张锋团队用金标层析格式的SHERLOCK成功地检测到浓度低至2aM的塞卡病毒RNA。整个测试只需1小时。

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31    金标SHERLOCK也可以被用来做癌症病人的快速液体活检。从非小细胞肺癌（NSCLC）患者的唾液样品中，他们可以检测到游离DNA中是否含有突变的EGFR基因（L858R）。至此，从多重化、定量化和去荧光三个方面，张锋团队在实验室里完成了对SHERLOCK的第一次技术迭代。

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32    在下一篇Science论文中，张锋实验室与哈佛的Pardis Sabeti实验室合作，继续将SHERLOCK向产业化的方向推进。这次他们的主攻方向是病毒即时检测。近些年来，全球屡遭各种病毒瘟疫的肆虐。如果我们在疫情初发时，就能开发出快速、准确的现场诊断方法（POCT)，那么疫情的扩散就可以得到有效的控制。这个方法要非常robust（“皮实”、稳健、抗干扰）和便捷，适用于各种条件。为了直接从患者的体液样品中分析、读取信号，两个团队发明了HUDSON技术（Heating Unextracted Diagnostic Samples to Obliterate Nucleases）, 通过加热的方式（还加了TCEP/EDTA）先灭活核酸酶再灭活病毒，最后通过SHERLOCK诊断。所有反应都在一个容器内进行，不需要换液、提纯（与图20对比）。他们可以用HUDSON+SHERLOCK从患者的血清、唾液或尿样中高灵敏度地检测出塞卡病毒的RNA——荧光或金标两种格式都可以。

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33   在疫区诊断时不但要知道是何种病毒感染，还要判断出是哪种病毒亚型。他们也设计了DENV的诊断套餐，从患者的体液样品中迅速诊断出含有哪种或哪几种亚型的DENV（右下图中上数第二个和第五个样品就携带两种亚型病毒）。这个套餐测试不是多重测试，而是把RPA扩增产物分成几份儿，通过不同的crRNA和相同的Cas13平行测定。测定结果非常准确，没有假阳性或假阴性结果。

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34    不是所有的塞卡病毒都一样。2017年9月， 中科院遗传所的许执恒团队和军事医学科学院的秦成峰团队在Science上报导，prM蛋白的一个突变(S139N)增加了塞卡病毒的传染性，并引起更严重的小头症和更高的致死率。在该论文发表后一周内，Sabeti团队和张锋团队就设计、开发出几个能区分出S139N病毒突变的SHERLOCK分析方法，包括荧光或显色格式。图中Ancestral或Anc代表最早起源的野生型（139S）塞卡病毒，Derived或Der代表衍生的突变型（139N），DOM代表来自多米尼加的患者， HND代表来自洪都拉斯的患者。

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35    2018年10月，在Science的又一篇论文中，Doudna团队也用“钓鱼”的方法为DETECTR技术平台找到了一个新的工具: Cas14。Cas14的第一个特点是它的个头小（40-70KD），不到其它Cas酶的一半，因而大规模生产该蛋白的难度相对较低。它的第二个特点是它只靶向单链DNA，激活后除了剪切靶ssDNA外，还非特异性地剪切其它ssDNA。

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36   根据Cas14的第二个特点，他们设计了Cas14-DETECTR。由于Cas14-sgRNA只识别单链DNA，RPA扩增产物需要被转变为ssDNA。他们用了一个巧妙的方法：在扩增DNA时，一对引物中只有一个含有phosphorothioate (PT)。扩增后，没有被PT保护的DNA链会被T7外切酶降解，而有PT保护的单链则幸存下来，继续被Cas14-sgRNA甄选。

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37    Cas14的第三个特点是它的识别序列没有PAM的限制，所以可以靶向任何序列。它的第四个特点是对识别序列中间的碱基的要求很严格，有一个错配就不能结合。也就是说，Cas14-DETECTR的特异性能达到单碱基，比Cas12-DETECTR的高（参照图25）。根据这一特点，Doudna团队用Cas14-DETECTR建立了高保真的SNP基因型分析方法。文中给的例子是区分蓝色眼睛和棕色眼睛的基因型。通过调控下游的OCA2基因，人的HERC2基因中第86个内显子的一个碱基的差别决定了眼睛颜色的差异：G是蓝色，A是棕色。通过对志愿者的唾液分析，他们可以迅速、准确地查出决定眼睛颜色的SNP基因分型。图中志愿者5-7的眼睛是蓝色 （GG纯和子），1-4的眼睛是棕色（1和2是AA纯和子， 3和4是AG杂合子）。

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38    至此，在CRISPR分子诊断技术中最常用的三个Cas系统已全部亮相。

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39   加上Cas9，它们为分子诊断和基因编辑提供了多样灵活的工具。

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40    CRISPR分子诊断技术并不是只有Doudna和张锋两家在开发。2019年3月，在Keck Graduate Institute任职的Kiana Aran博士与合作者在Nature Biomedical Engineering的一篇论文中展示了一个全新技术CRISPR-Chip。这一技术将CRISPR和石墨烯膜场效应晶体管（gFET）技术结合起来。以石墨烯膜为基础的晶体管上载有dCas9（只有识别功能，没有剪切功能）和sgRNA的复合体。当样品滴加到膜上，一旦dCas9-sgRNA识别并结合相应的靶DNA分子，晶体管就发出一个电信号。在SHERLOCK和DETECTR中，“剪切”产生信号；而在CRISPR-Chip中，“结合”产生信号。与SHERLOCK、DETECTR相比，CRISPR-Chip技术的缺点是需要特制的仪器，但优点是待测DNA不需要扩增。Aran联合创立了一家生物传感器公司NANOSENS来开发CRISPR-Chip技术。

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41  Doudna联合创立了Mammoth Biosciences以专注开发DETECTR技术。Mammoth在2018年4月公开亮相，并于同年7月宣布成功完成A轮融资2300万美元。公司的其他几名联合创始人都是刚毕业不久的博士。其中，Chen和Harrington曾是Doudna的博士研究生，刚于2018年毕业，是2018年2月和10月那两篇Science论文的并列第一或第二作者。

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42   张锋联合创立了Sherlock Biosciences专注于开发SHERLOCK技术。公司虽然在2019年3月才成立，但已经融资4900万美元。前文提到的两名联合创始人Abudayyeh和Gootenberg曾是张锋的博士生，也刚毕业不久。但与Mammoth的创始人的情况不同，两人决定继续在学术界耕耘，而把公司交给资深专业团队管理。

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43    CRISPR分子诊断技术虽然还没有产品上市，但前景一片光明。CRISPR-Dx是典型的“颠覆性创新”，先从低端市场（POCT）切入，但有改变IVD产业格局的巨大潜力。 它既具有qPCR、ddPCR等其它分子诊断技术的卓越性能，又不依赖于复杂的仪器，而且具有金标免疫层析方法的方便性和低成本。CRISPR-Dx极有可能比CRISPR-Rx更快地到达市场。

44   我们可以预料，Doudna和张锋未来在CRISPR分子诊断领域也会有专利之争。双方在CRISPR基因编辑和Cas9上的知识产权之争到现在还无定论。但如图所示，和基因编辑IP有一点不同的是，双方与诊断有关的主要专利申请都是在2013年之后递交的。2013年3月，美国专利归属从“first-to-invent”转变为“first-to-file”系统。也许在新的系统下双方的专利权划分会清楚一些。但他们关于诊断的IP有不少重叠，完全分割清楚并不是一件容易的事。双方最好的选择也许是签署合作协议，交叉许可各自的专利。

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45   也许多年以后，Doudna和张锋回首往事，会对曾有过的专利之争一笑了之。也许多年以后，我们回望这段岁月，才意识到这是一个风起云涌、英雄辈出的时代。而我们则有幸见证甚至参与了一连串的革命性生物医学技术的诞生和普及：anti-PD-1/PD-L1, CRISPR, CAR-T, iPSC, NGS……星汉灿烂，若出其里，人类的创造力无穷无尽。这更是一个创新的时代。（完）

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