从免疫学基本原理到免疫比浊技术的应用

一谈到免疫学，离不开的就是抗原和抗体，之前简单谈过有关医学免疫学和抗体的制备技术，今天详细介绍抗原抗体的知识以及免疫比浊技术的应用。

抗原（Antigen, Ag）

是刺激机体产生免疫应答的物质，这里面有应答两个字比较重要，“应”是指抗原刺激机体产生免疫应答产物--抗体或免疫效应细胞，“答”是指相应抗原与免疫应答产物结合并将其排除体外。

抗原具有两性，免疫原性和免疫反应性。免疫原性是指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答（产生特异性抗体及免疫效应细胞）的性质。免疫反应性是指抗原分子与免疫应答产物（抗体或免疫效应细胞）发生特异性结合的性质。

抗原有两类，半抗原和完全抗原。抗原最重要的结构是抗原决定簇。抗原分子存在的能TCR/BCR或抗体Fab片段特异性结合的特殊化学基团，是免疫应答特异性的物质基础。

   抗原具有的结构

   抗原决定簇：抗原分子存在的能TCR/BCR或抗体Fab片段特异性结合的特殊化学基团，是免疫应答特异性的物质基础。

   构象决定簇 ：构象决定簇（conformational determinant）由空间构象形成的决定簇，序列上不连续。

   顺序决定簇：顺序决定簇（sequence determinant），又称线性决定簇（linear determinant），序列相连续的氨基酸肽片段构成的决定簇。

   抗原结合价：抗原结合价（antigenic valence）是指能够与抗体分子结合的决定簇数目

   共同表位（common epitope）指不同抗原之间含有的相同或相似的抗原表位。

   交叉反应（cross-reaction）指抗体或致敏淋巴细胞对具有相同或相似表位的不同抗原均具有的反应（交叉结合）。

   抗原表位的性质、数目、位置、空间排列和立体构象决定着抗原-抗体反应的高度特异性。

抗体（antibody, Ab）

是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗原发生特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。抗体主要存在血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小肠粘膜液、唾液以及乳汁等其它体液中。

抗体的本质是免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）是一类具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。抗体一定是球蛋白，球蛋白未必是抗体。

抗体的结构

从宏观上看抗体的形状是“Y”形，由四条链构成，两条重链，两条轻链和种类。分为可变区和恒定区

抗体的种类根据重链的不同抗体分为5类，分别是IgG—γ，IgA—α，IgM—μ，IgD—δ，IgE—ε

抗原抗体结合

抗原与抗体能够特异性结合：是基于两种分子间的结构互补性与亲和性，这两种特性是由抗原与抗体分子的一级结构决定的。

   抗原抗体反应可分为两个阶段。

   第一阶段抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应。

   第二阶段可见反应阶段，抗原抗体复合物在环境因素（如电解质、pH、温度、补体）的影响下，进一步交联和聚集，表现为凝集、沉淀、溶解、补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。

   抗原抗体结合的特点，根据抗原或抗体量的多少会形成前带和后带反应。

影响抗原抗体反应的因素

电解质（离子强度）：抗原与抗体发生特异性结合后，虽由亲水胶体变为疏水胶体，若溶液中无电解质参加，仍不出现可见反应。为了促使沉淀物或凝集物的形成，常用0.85％氯化钠或各种缓冲液作为抗原及抗体的稀释液。由于氯化钠在水溶液中解离成Na+和C1－，可分别中和胶体粒子上的电荷，使胶体粒子的电势下降。当电势降至临界电势（12～15mV）以下时，则能促使抗原抗体复合物从溶液中析出，形成可见的沉淀物或凝集物。

   酸碱度（pH）：抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行。蛋白质具有两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应一般在pH为6～8进行。pH达到或接近抗原的等电点时，即使无相应抗体存在，也会引起颗粒性抗原非特异性的凝集，造成假阳性反应。

   温度：在一定范围内，温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速。但若温度高于56℃时，可导至已结合的抗原抗体再解离，甚至变性或破坏；在40℃时，结合速度慢，但结合牢固，更易于观察。常用的抗原抗体反应温度为37℃。每种试验都有其独特的最适反应温度，例如冷凝集素在4左右与红细胞结合最好，20℃以上反而解离。

   其它：适当振荡也可促进抗原抗体分子的接触，加速反应。

   那么针对抗原抗体反应的检测技术有哪些呢？

铺垫了这么多免疫比浊技术终于出现了！

免疫比浊，顾名思义将液相内的沉淀反应与现代光学仪器和自动分析技术相结合的一项分析技术。当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含量。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度成正比例相关

免疫比浊技术的分类：按光路，按时间，按增敏剂不同也有好多分类。

这里面会涉及透射比浊和散射两种方法学的比对。

在免疫比浊分析中主要影响因素有

1、抗原抗体的比例，比例要适当，

2、抗体的纯度与效价，诊断试剂应尽可能选用高纯度和高效价的抗体，

3、免疫复合物的大小及稳定性，溶液中免疫复合物颗粒的分散度尽可能相同，颗粒应该不容易相互聚集，

4、增聚剂，利用增聚剂破坏抗原抗体的水化层

5、离子强度，PBS是较好的反应液

   在分析当中会出现伪浊度的影响

   抗血清含有非特异性的交叉反应性杂抗体成分；增浊剂浓度和反应时间掌握不当；样品本身的浊度处理不当；试剂的污染和变质；器材尤其是比色杯等不够清洁。

   以及非特异性散射光的影响

   免疫浊度法经常受内源性光散射的干扰，为避免这些非特异性光散射的影响，应用投射比浊法时需保证抗体组分在3%以下，散射比浊法需保证在0.5%以下。

   在IVD诊断试剂盒研发当中通常制备乳胶增强免疫比浊的方法来进行定量诊断。胶乳颗粒增强比浊法（Latex particle-enhanced turbidimetric immunoassay, LETIA）属于普通免疫比浊的衍生技术，是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。

   选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒吸附或交联抗体后，当遇到相应抗原时，则发生聚集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过。当两个胶乳颗粒凝聚时，则使透射光减少，这种减少的程度与胶乳凝集成正比，当然也与抗原量成正比。反应液吸光度的改变与被测抗原的浓度在一定范围内具有线性关系，可用来反映被测抗原的浓度。

   其特点变非均相反应为均相反应，灵敏度提高（≥0.1ng/mL）；聚乙烯、聚苯乙烯等高分子胶乳颗粒，直径100-200nm；以物理吸附（多抗）或化学交联（单抗）方式与抗体连接；基于单抗胶乳免疫散射速率比浊技术的定量分析是发展方向。

乳胶增强免疫比浊这里就需要利用抗体偶联技术来进行制备了，以下是制备流程：

   免疫比浊技术的应用，极大的提高了临床诊断的准确性，对于免疫诊断，凝血诊断大部分的检测项目都会用到这个技术，而在相关试剂盒研发过程中，最重要的就是单克隆抗体的制备和微球的选择，可想而知，一个试剂盒的研发所需要储备的知识，经验是多么的重要。