应规范男科实验室的检测项目

过去的一二十年，男科学的发展十分迅速，新的检测项目也不断引入临床，并已成为常规检测项目。然而，其中一些检测项目有明显的缺陷，却仍被临床和科研工作者大量应用。例如，反映精子DNA损伤的精子DNA碎片化指数(DFI)自2002年引入临床后已被大量男科实验室开展；反映男性生殖道隐性感染的精液弹性蛋白酶检测，自20世纪80年代报道后，也逐步被开发为试剂盒用于临床常规检测；2014年报道的前列腺小体外泄蛋白(PSEP)未经大量临床验证即迅速进入临床常规检测。这些检测项目有几个共同特点：(1)临床收费较高，高达数百元；(2)自推广进入临床常规检测后，尽管有临床医师怀疑其结果与患者临床表现不一致，但一直默默地在临床使用；(3)不论临床还是科研中使用这些指标时，几乎是同样的检测方法，出自同一原始文献，似乎从未有人怀疑过。出现这种现象的根本原因可能有两个：利益驱使，收费高必然带来高回报，其有无临床意义并不重要；一些曾经怀疑过这些检测项目的医务人员，认为试剂厂家既然提供了试剂盒，其必定经过了严格的验证，再加上大量重复文献的报道，自己想反驳也感到力不从心。

这些不合理检测项目的常规开展不仅大大增加了患者的经济负担，而且会给临床医师造成误诊或漏诊，延误患者的及时治疗。因此，纠正男科实验室的不合理检测刻不容缓，相关管理部门加强对新开展项目尤其是高收费项目的验证和督察，对维护合理、规范的临床诊疗和减轻患者的经济负担具有重要意义。而且，这样的不合理检测项目除了在男科实验室存在外，在医学检验其他实验室同样存在。本文将对上述3个检测项目的不合理的地方进行阐述，希望引起临床相关人员及相关管理部门对此现象的高度重视。

研究显示，DFI检测可作为精液常规检测的重要补充，可用以预测自然妊娠和体外受精的结局，监测各种环境污染物和干预措施对精子DNA的损伤，以及评估男性生殖系统疾病及其治疗对精子DNA损伤的影响^[1]。且专家推荐，在严格选择最佳临床适应证的前提下，DFI检测可以成为评估男性不育及辅助生殖结局的重要指标^[2]。在目前的文献报道中，检测DFI的方法绝大多数为SCSA法，而此法的检测原理基本源于Evenson和Jost^[3]于2000年发表的一篇文献。

目前我国男科实验室的精子DFI检测试剂盒对精子DFI的分析原理与Evenson和Jost^[3]一文中的原理相同。此DFI分析法中的有些不合理内容，提出如下观点，供商榷。

1．设门随意，缺乏理论依据。综观流式细胞术相关图书^[4,5]，对各类细胞的分析几乎毫无例外地采用十字象限门，精子作为人类细胞的一种同样适用。十字象限门的关键是确定十字象限的交叉点，对吖啶橙(AO)染色的精子而言，就是正常精子最低绿色荧光和最低红色荧光的界限。十字象限门一旦确定，各象限的细胞特性基本确定，第一象限和第四象限之和应为DFI。而目前的DFI检测中，却画出了从未见过的梯形门，DFI仅指绿色荧光75%以下的主群外细胞(COMP)，而绿色荧光75%以上的细胞却画为另一个门，认为是高DNA可染色性(HDS)精子即不成熟精子。这种如此随意的设门法令人费解。

2．计算方法有误。现有精子DFI分析中，所有参数的获得均是基于αt变量来的，文献中对αt的定义为：αt＝红色/(红色＋绿色)荧光。很明显，这是一个错误的定义。αt定义的成立只应限于，精子DNA结合AO后发出红色和绿色荧光的强度相同。而实际上，精子DNA结合AO发出绿色荧光的强度约是红色荧光强度的5～6倍。另外，DFI的定义为含有碎片化DNA精子占总精子的百分率，其应以数量表示，而不应该以荧光强度来表示。

3．毫无意义的HDS参数。Evenson和Jost[3]认为不成熟的精子经AO染色后绿色荧光强度增加，同时作者也承认，对HDS这个参数不像SCSA中其他参数那么明确，且缺乏足够的经验。针对HDS，从未见过其他文献如此描述，一个具有正常DNA的细胞，经AO染色后绿色荧光越强，DNA反而越不成熟，如果如该文作者所言，用荧光显微镜观察的绿色荧光精子中有许多是不正常的，也从根本上颠覆了AO染色鉴别DNA损伤的可能，那SCSA法检测的原理就已被全盘否定；而且，HDS中既包含没有红色荧光的精子(正常精子)，又包含具有很强红色荧光的精子(与绿色荧光混合后呈现橘黄色荧光)。也许正因为如此，HDS参数一直被相关学者认为是没有任何意义的，故在临床诊断中也极少应用。

据上分析，现有的DFI结果明显偏低，因为其将第一象限中75%绿色荧光分界线以上的碎片化精子完全排除；而且，αt的引入，使DFI结果更不确定，因为在第一和第四象限中的精子，随着绿色荧光的成倍增加，αt值将会降低，本应归为异常的精子，经过αt的公式运算后将变为正常精子。可以说，一个并不复杂的DFI分析过程，由于设门的随意性，计算方法的不合理，再加上仪器分析过程的完全封闭，其结果的可靠性受到严重质疑。因此，目前急需在合理分析DFI结果的基础上，进一步使DFI的SCSA检测法更加标准和受控。

中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)是一种重要的中性蛋白水解酶，直接参与体内各种生理和病理过程，在感染性疾病发生、组织损伤和炎症等诸多方面起着重要介质作用^[6]。正常生理情况下，由巨噬细胞、中性粒细胞分泌的弹性蛋白酶量很少，并不断与抗蛋白酶系统如α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)和α2-巨球蛋白(α2-MG)结合形成复合物而被巨噬细胞、中性粒细胞吞噬清除，蛋白酶和抗蛋白酶之间保持着一种动态平衡，因而不会引起正常组织的破坏和损伤^[7,8]。当炎症发生于男性生殖系统时，中性粒细胞分泌大量弹性蛋白酶，使得弹性蛋白酶含量和活性明显增高，部分弹性蛋白酶被抗蛋白酶结合而失活，而未能结合的有活性的游离弹性蛋白酶会降解邻近组织的弹性蛋白、多黏蛋白、基底膜和胶原纤维等，从而使男性生殖系统造成损伤。因此检测精液有活性的游离弹性蛋白酶才可以真正反映男性生殖道炎症程度^[9]。

在PubMed上以"semen"和"elastase"检索，约有100余篇文献与精液弹性蛋白酶有关。在这些研究中以及我国目前临床上广泛使用的精液弹性蛋白酶检测法，基本上为ELISA法^[7,10]。其基本原理为：包被于固相载体的抗弹性蛋白酶抗体可与精液中弹性蛋白酶-α1抗胰蛋白酶抑制剂复合物相结合，结合的待测物再与酶标记的抗α1抗胰蛋白酶抑制剂抗体结合，结合的酶可催化底物显色，有色产物的吸光度与精液样本中弹性蛋白酶-α1抗胰蛋白酶抑制剂复合物浓度呈正相关。此种方法检测的是精液中弹性蛋白酶-α1抗胰蛋白酶抑制剂复合物^[10,11,12]，而非游离弹性蛋白酶。而在精液样本中，与α1抗胰蛋白酶抑制剂结合的弹性蛋白酶为已失活的酶，而真正在炎症过程中起作用的是游离弹性蛋白酶，因此，此种方法的设计存在明显缺陷，不适合在临床上进一步开展。奇怪的是，尽管有研究者未得到精液弹性蛋白酶与精子质量参数和精液中性粒细胞之间的相关性结果^[13,14]，但几乎从来没有研究者怀疑被建立的检测方法的可靠性。

PSEP检测试剂盒使用说明书提示^[15]，该试剂盒主要用于定量检测人体尿液中PSEP的含量。试剂盒说明书的预期用途中提到：大量临床实验结果证明，在慢性前列腺炎患者的尿液中，PSEP含量会升高，这是临床慢性前列腺炎诊断的一个可靠的指标。该试剂盒的检测原理为：直接将100 μl尿液加至微孔板中，37 ℃下包被1 h，然后依次加入封闭液、PSEP结合抗体、酶标抗体及显色液等，最后加入终止液后于450 nm下测定OD值。根据已包被的5个阳性标准品的OD值，计算出尿液样本的PSEP含量。该检测不合理的地方主要有：

1．PSEP究竟是何种物质，没有任何文献支持。以"前列腺小体外泄蛋白"为关键词，通过百度搜索，共有6篇相关文献。其中，1篇为参加学术会议交流论文^[16]，1篇为专利^[17]，1篇为硕士学位论文^[18]，研究论文3篇^[19,20,21]。其中，有4篇文献基本重复。而以文献中出现的前列腺小体外泄蛋白的英文名称"prostaticexosomal protein"通过PubMed搜索，未发现一篇英文文献。因此，该检测方法检测的究竟是何种物质，不得而知。但几乎没有任何文献支持的一项指标就轻易进入临床应用，是一件值得深思的事件。科学技术、循证医学等概念在此检测中毫无体现。

2．即使前列腺炎患者PSEP升高，其是如何从前列腺进入尿液的？相关证据无从核查。临床上怀疑有前列腺炎时，通过前列腺按摩可检查前列腺按摩液成分的变化辅助诊断前列腺炎。前列腺和膀胱尽管相邻，但是为两个独立的器官，在正常情况下，即使是前列腺的外分泌成分也是很难进入膀胱到达尿液的。有专家在多次学术会议上提出，PSEP的检测是参照Lu等^[22]的文献。而Lu等^[22]研究的是前列腺癌患者的尿液中可出现黏附相关蛋白——δ连环蛋白，其是有可能的，因为肿瘤本身就有侵袭特性。可目前临床检测的PSEP，与此文献并无关联，研究对象和方法完全不同。

3．检测方法很不标准，随意性大。常规检测蛋白抗原所用ELISA法为双抗体夹心法，可令人费解的是，目前临床检测PSEP所用方法为间接ELISA法，让抗原包被这一步留给了实验室操作人员。众所周知，抗原包被要有专门的包被液(pH 9.6的碳酸盐缓冲液)，可目前临床检测方法却是直接加100 μl尿液；一般包被至少2 h或者过夜，可临床上只需1 h；包被时抗原要有固定的浓度，可临床上加入的尿液中，各种排泄的代谢产物很多，杂质很多；而且，尿液的pH值偏酸，目的蛋白能否包被上以及蛋白结构是否被破坏，均是未知数。目前这种包被的结局必然是大量的非特异性吸附物，所以检测的结果也注定是非特异性反应。另外，作者提供的标准品是已经包被好的，而不是与尿液样本一起包被，也就是反应的第一步就未得到控制，这种设计是明显错误的。

总之，目前男科实验室仍有不少不合理的检测项目在临床上使用，有的存在明显的科学设计错误；有的过分扩大临床意义，缺少循证医学支持；有的方法学设计与临床意义明显脱钩。这样的现象在医学检验实验室可能同样存在，须引起相关监管部门的高度重视。

选自中华医学杂志2018,98(46)