循环肿瘤细胞的逃逸及其检测

血液中的循环肿瘤细胞来源于癌症原发病灶或转移病灶，虽然释放到血液循环系统的肿瘤细胞具体数目未知，但是通过建立的实验模型预测，肿瘤持续性的释放数百万计的肿瘤细胞至全身。但是由于脱离肿瘤部位的肿瘤细胞容易凋亡，同时人体免疫系统也在不断地清除循环系统中的肿瘤细胞，因此只有极少部分的循环肿瘤细胞能够存活，随着循环系统转移到其他器官。发生转移的肿瘤细胞往往更难以被发现，因为转移到其他部位的一部分肿瘤细胞可能会停止分裂，进入休眠期，直到合适的环境、时机，再重新进行分裂增殖。这种休眠阶段被称为临床癌症休眠，可以持续10年之久。同时这也是癌症难以被根治的重要原因之一。

△肿瘤细胞的逃逸机制

肿瘤进入血液循环系统的可能方式主要有两种，一种是被动转移，另外一种是主动转移。

被动转移是由于肿瘤在扩增过程中，外部的肿瘤细胞受到挤压和拉拽，而被释放到血管当中。尽管被动转移的过程机制至今没有完全了解清楚，一个合理的解释是，在肿瘤生长过程中，会释放出血管内皮生长因子，诱导生成肿瘤血管，向肿瘤输送氧气和营养。由于肿瘤生长极快，肿瘤血管内皮细胞间隙过大。肿瘤生长过程中不断向外挤压，外部的肿瘤细胞被“挤”入到血管内部（上班挤地铁既视感）。这种“意外”进入血管中的循环肿瘤细胞极大地保留了肿瘤的原始形态，可以通过特定地上皮细胞特异性标志物进行检测，如表皮细胞吸附分子（EpCAM）。

主动转移的过程更为复杂。肿瘤细胞在侵袭过程中，会利用一种上皮-间质转化机制（epithelialto-mesenchymaltransition，EMT），由类粘附性更强的上皮性，转化为结构更为松散的间质细胞性，从而获得转移和侵袭能力，进入到血液循环中。

循环肿瘤细胞被认为是实时的“液体活检”。

1、肿瘤早期检测

一项针对慢性阻塞性肺病（COPD）的研究表明，在临床可诊断之前，即可检测出循环肿瘤细胞。该研究对168例患有COPD的病人进行跟踪监测，每年进行低剂量螺旋CT检查，以及循环肿瘤细胞检测。早期一共有5例可检测出循环肿瘤细胞，针对这5例CTCs阳性的病人，螺旋CT分别在1至4年之后才检测到肺部结节，并被确诊为早期肺癌。

2、肿瘤转移复发预警

肿瘤转移是肿瘤发展的终末期，也是肿瘤病人死亡的主要原因，目前常规检测肿瘤转移的方法主要是影像学的方法。但是发生在早期或者术后的细胞水平的肿瘤转移，影像学方法无法进行侦测。循环肿瘤细胞检测为早期肿瘤转移提供线索，评估治疗后肿瘤复发的风险。一项由约翰.霍普金斯大学医学院发起的针对胰腺导管癌的临床试验表明，循环肿瘤细胞的变化可早于影像学证据提示肿瘤复发，而未复发的肿瘤病人中，则未出现循环肿瘤细胞的增加。另外，一项针对早期乳腺癌、前列腺癌病人治疗后跟踪研究分析发现，如果循环肿瘤细胞呈持续性的升高，其预后更差，更有可能复发。

3、指导靶向治疗

肿瘤靶向治疗是现阶段肿瘤治疗的精准武器。一个典型的例子是曲妥珠单抗靶向性治疗HER-2过表达的乳腺癌患者。目前的靶向治疗前评估分析主要针对原发部位肿瘤组织，或者局部转移灶肿瘤组织，但是同一个病人的不同的转移部位肿瘤细胞可能存在差异，而要针对每一个转移部位进行分析是一项繁杂而浩大的工程。液体活检——循环肿瘤细胞检测为全面评估提供了可能。转移至其他部位的肿瘤细胞与原发病灶一样，会不断向人体内释放循环肿瘤细胞，因此，循环肿瘤细胞检测更有可能为靶向治疗或肿瘤耐药分析提供更全面的信息，避免无效患者的过度治疗。

△循环肿瘤细胞的临床应用——个性化治疗

由于循环肿瘤细胞在血液中存活时间较短（半衰期1-2.4小时），因此血液中的循环肿瘤细胞非常稀少，大约109个血细胞中才含有1个循环肿瘤细胞。而在肿瘤发生明显转移之前，早期病人体内的循环肿瘤细胞数量会更少，在浩瀚的血液细胞群中将肿瘤细胞分离出来是一项巨大的挑战。

目前循环肿瘤细胞分离富集的方法主要可以分为两大类，一类是根据肿瘤细胞的物理特性，采用非特异性分离方法，如细胞尺寸、细胞密度，细胞电荷等进行分离。另一种是采用特异性的生物学特性进行特异性分离。

△循环肿瘤细胞分离方法

特异性分离的前提是特异性抗原存在于肿瘤细胞中。在众多抗原中，最常用的特异性抗原是上皮细胞粘附性分子（Epithelial cell adhesionmolecule，EpCAM)。作为FDA批准的唯一一个循环肿瘤细胞检测产品，CellSearch系统采用的也是这种方法。如图所示，将抗-EpCAM抗体包被在磁颗粒表面，通过外加磁场，将表面有EpCAM抗原的循环肿瘤细胞分离富集。随后通过仪器将循环肿瘤细胞固定，再加入荧光抗体进行标记。所使用的荧光标记抗体包括藻红蛋白（PE）标记的细胞角蛋白（CK），包括CK8，CK18和CK19，以及采用别藻蓝蛋白（APC）标记的CD45抗体。此外，还有专门用于细胞核染色的DAPI组分。系统会自动筛选CK阳性事件供检测者判读，符合肿瘤细胞形态且呈CK阳性，DAPI阳性，CD45阴性的即可定义为循环肿瘤细胞。

特异性分离还可以采用负向分离的方式进行循环肿瘤细胞的分离富集。较常用的策略是，采用抗CD45抗体标记磁颗粒，继而对血液中的白细胞进行磁标记，通过外加磁场将大量白细胞去除。剩余的细胞可再进一步采用正向分离的方式进行筛选。

有些肿瘤细胞，比如皮质-间质转化肿瘤细胞EMT循环肿瘤细胞并不表达EpCAM抗原，导至常规的EpCAM磁颗粒正向分离无法捕获该类细胞。因此，近些年，也有发展出微流控技术，通过结合不同的抗体，进行循环肿瘤细胞的捕获分离。多种抗体的混合，包括如叶酸受体、HER2、EGFR、粘蛋白、干细胞表面抗原等相关抗体进行混合使用，最大可能的捕获各类循环肿瘤细胞，为临床提供更加准确而全面的信息。

定量检测循环肿瘤细胞对于监测肿瘤治疗、评估肿瘤转移、预后具有重大意义。通过对循环肿瘤细胞的分子水平分析，能够更加全面的评估肿瘤细胞特性，指导精准治疗。但是，目前许多循环肿瘤细胞检测技术还需要得到更多的临床验证评估，循环肿瘤细胞检测技术得到全面的临床应用依然任重道远。

-Reference-

1. Joosse S A,Gorges T M, Pantel K. Biology, detection, and clinical implications ofcirculating tumor cells[J]. EMBO molecular medicine, 2015, 7(1): 1-11.

2. van de StolpeA, Pantel K, Sleijfer S, et al. Circulating tumor cell isolation anddiagnostics: toward routine clinical use[J]. 2011.

3. Alix-PanabièresC, Pantel K. Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer[J]. Clinicalchemistry, 2013, 59(1): 110-118.

4. Alix-PanabièresC, Pantel K. Clinical applications of circulating tumor cells and circulatingtumor DNA as liquid biopsy[J]. Cancer discovery, 2016, 6(5): 479-491.

5. 刘文静, 刘毅, 刘晓晴. CellSearch系统检测循环肿瘤细胞及其分子标记的研究进展[J]. 临床肿瘤学杂志, 2012, 17(2): 182.

6. Pecot C V,Bischoff F Z, Mayer J A, et al. A novel platform for detection of CK+ and CK−CTCs[J]. Cancer discovery, 2011.