IVD质量管理系列の技术篇酶联免疫分析法（下）

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一、概述：

上文已经介绍了免疫检测试剂运用的各方法学的检测原理及其适用性，各种方法有其自身的优势，也有必然的缺陷。本章节主要介绍免疫诊断检测中存在的缺陷、干扰因素及其处理方法，让读者进一步掌握免疫诊断试剂方法学特点，在产品质量控制方面带来一定的启示。

免疫反应动画

二、存在的缺陷、干扰因素及其处理方法：

2.1 钩状效应：在夹心一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。

因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。通常，检测某种物质时遇到HOOK效应的情况实际上是很难察觉，除非同时有其他方法的对比结果或该种物质被检测为阴性，与临床诊断结果不相符。要验证是否存在hook效应，可以对待测样本进行梯度稀释，如果稀释后检测结果反而升高，证明了HOOK效应的存在。要避免HOOK效应，固相包被的抗体和标记抗体应分别针对的不同抗原决定簇来设计。

2.2 表面效应：固相化包被的抗原和抗体，在吸附于载体后其分子结构发生变化或结合位点被屏蔽，影响抗原抗体反应导至假阴或者含量检测结果降低

2.3 边缘效应：在ELISA的测定中，由于四周孔与中央孔的升降温速率不一致，导至的四周孔结果比中央孔高的现象。实验过程中对检验设施条件、环境条件尽可能做到均匀分布。

2.4类风湿因子（RF）的干扰：双抗体夹心法测抗原需要注意的是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。

类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体，导至假阳性反应【假阳性的反应模式：固相-抗u+样本RF+酶标（IgG）抗体】。

采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。样本稀释液中可以添加经63℃，10min热变性的IgG同样可以去除RF的干扰。另外可以使用特异的鸡抗体IgY，RF不会与鸡IgY发生反应。检测抗原时，可以使用2-巯基乙醇加入标本稀释液中降解RF的影响。

2.5补体干扰：来自哺乳动物的固相抗体和酶标抗体均有激活人血样本中的补体系统的功能（在这里特别注意的是稀释液中的动物血清或者动物血清制品、人血或人血制品也存在的补体成分）。一方面在固相抗体、标记抗体的吸附和结合过程中，抗体分子发生变构，Fc段的补体结合位点暴露，导至样本中的补体可以将二者结合起来产生假阳性。另一方面，固相抗体活化而被补体结合，也会导至本身的抗原结合位点被封闭而造成假阴性。可以使用EDTA样本稀释液或56℃，30min灭活补体的方法。使用鸡IgY抗体作为固相和酶标抗体。

2.6 “HAMA效应”的干扰：双抗体夹心法测抗原的另一注意点是“HAMA效应”的干扰，导至假阳性或假阴性：

1）使用鼠源性单抗作为包被、标记抗体，检测标本中含HAMA（人抗鼠抗体），将会和固相抗体和标记抗体结合成夹心复合物，显色后呈假阳性。

2）使用鼠源性单抗作为包被、标记抗体，检测标本中含HAMA（人抗鼠抗体）和待测标志物，HAMA含量足够高将会和待测标志物竞争固相抗体、标记抗体结合而无法形成夹心复合物，不显色而呈假阴性。

造成HAMA效应的来源主要有被鼠类咬伤的患者、接受过单抗类药物治疗的患者体内均会产生人抗鼠抗体。可以在样本稀释液或酶标稀释液中添加“鼠抗体”而阻断HAMA效应，也可以使用鸡IgY抗体作为固相、标记抗体。

2.7异嗜性抗体干扰：人血样本中含抗啮齿动物（鼠、马、羊）抗体的抗体，异嗜性抗体可交联固相抗体、酶标抗体而成假阳性。但不同的异嗜性抗体结合区域不同，一类是结合羊、鼠、马、牛的IgG的（Fab）区域，一类是结合鼠、马、牛、兔IgG的Fc区域。因此，可采取以下方式处理：

使用兔F（ab）’作为固相或酶标抗体、在标本稀释液中加入过量的动物Ig（如山羊、新生牛血清）、使用鸡IgY作为固相和酶标记抗体。

2.8 小结：免疫测定中存在诸多的干扰因素，作为产品设计人员需要考虑在设计开发中根据不同检测方法、针对不同待测样本采取不同的风险控制措施。而生产质量控制人员，应在原材料检验、工艺验证和企业参考品制备时考虑相关因素的验证。

参考文献

《分子免疫学基础》，王重庆编著，2003.北京大学出版社。

《临床酶免疫测定技术》，李金明，2005.人民军医出版社。

来源：小桔灯网丨作者：大漠孤鹰