高效毛细管电泳在检验医学中的应用前景

作者： 沈霞

上海交通大学附属新华医院检验科

高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis, HPCE) 是在传统电泳基础上继现代高效液相色谱技术之后发展起来的一种新型高效的液相分离技术。它是指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品各组分之间滴度和分配行为上的差异而实现分离的一种液相分离技术，称为毛细管电泳（ capillary electrophoresis， CE）。

毛细管电泳仪的发展

早期的电泳技术是由瑞典Uppsala大学的Tiselius教授创立，1948年获诺贝尔化学奖。随后出现了以醋酸纤维膜、琼脂糖凝胶作为介质的区带电泳。1967年由Hjerten 率先提出了在3mm内径管中进行自由溶液的区带电泳（zone electrophoresis，ZE)。此后，由Virtanen 于1974年采用200-500 μm内径的毛细管进行电泳，并证明分离的优越性。1981年，由Jorgenson 和Lukacs 使用75 μm 内径的玻璃毛细管和荧光检测器进行在线检测，在30 kV 电压下分离氨基酸和多肽类物质，塔板数高达40万。于1983年将聚丙烯酰胺凝胶电泳移植成为毛细管凝胶电泳。1984年使用含有表面活性剂的电解质，开辟了毛细管电泳另一重要分支- 胶束毛细管电动力学色谱。1987年又结合传统的等电聚焦电泳和凝胶电泳原理，并移到毛细管内进行电泳。1988年实现了微量制备的可能性，提取和分离了50μmol 的蛋白质、肽和寡核苷酸等。于1989年第一批毛细管电泳仪（P/A CE2000)进入市场, 1990年又改进和应用了紫外检测器，1991年液相色谱-毛细管电泳-系统兼容软件 P/ACE 2100 和 1992年激光诱导荧光检测器CE-MS（质谱）联用系统诞生，具有CE的高分辨率和质谱的灵敏度特征。1993年 P/A CE2200和P/A CE5000、5510系列及全自动毛细管电泳仪Capillarys 2 Flex Piercing、Neonat Fast和Minicap Flex Piercing问世。本世纪以来商品化的毛细管电泳仪不断改进和更新，是现代电泳技术发展的又一新里程碑，意味着高分离效率、超高分辨率分离时代的来临。

毛细管电泳仪的基本原理

高效毛细管电泳是一种在空芯的、极微小内径的毛细管中进行的液-液相大、小分子的高效蛋白分离技术。毛细管两端分别浸入缓冲液中，而缓冲液中分别插入连有高压电源的电极，根据被分离物之间电荷和体积的不同，带电荷分子朝相反极性的电极方向移动。又利用毛细管内壁上的电荷和应用的势能而引起的电解质移动，毛细管内表面带有硅羟基基团，当毛细管内充满缓冲溶液时，毛细管壁上的硅羟基发生解离，生成氢离子溶解在溶液中，这样就使毛细管壁上形成双电层，管壁是负电荷层，溶液是正电荷层。在毛细管的两端加上直流电场后，带正电的溶液就会整体向负极端移动，形成了电渗流。无论是带正电、带负电或不带电的粒子，都在电渗流的作用下，向阴极迁移，带正电的，受到同方向的电场力作用，迁移最快，不带电的迁移速度次之，带负电的迁移速度最慢，（因为它受到与电渗流反方向的电场力作用），从而实现各蛋白组分的分离。 该高速电泳分离系统整合了一个高精度Peltier自动温控装置，能够对毛细管中产生的焦耳热进行实时精确稳定的控制，是保证CE 有效分离的关键。分离后的样本各蛋白组分在毛细管末端，由多波长检测器在特定波长下进行直接检测，检测结果完全数据化、信息化管理。

毛细管电泳仪的几大优势

1. 自动进样系统 完全实现全自动原始管上样，操作人员只需将带有条形码的原始管放在仪器试管架上，初始操作完毕后即可离开，电泳仪将自动连续运行样品，无须人为干预。样本经仪器自动稀释后，由高精气压控制的纳升级样品进样系统将样品精确地吸入毛细管内部。

2. 专利样品温控系统 该高速电泳分离系统整合了一个高精度Peltier自动温控装置，能够对毛细管中产生的焦耳热进行实时精确稳定的控制，是保证CE 有效分离的关键，使CE的实验重复性达到应用要求。

3. 多种检测器选择 紫外光/可见光、二极管阵列、激光诱导荧光、电导及通向外部的接口。

4. 多用途毛细管电泳仪器可以进行多种临床项目的检测。

5. 检测结果完全数据化、信息化管理 利用互联网技术，实现各项检测结果的传输，包括曲线，工作流程和结果报告，并可建立实验室内部网络资库。

毛细管电泳仪的临床应用

经过20余年的发展，毛细管电泳技术和分析系统及试剂有了长足的进步，市场上已有多家毛细管电泳供应商，通常可以分为二大类型：临床型和科研型。临床型毛细管电泳技术在检验医学中的应用:

1. 血清蛋白血清蛋白电泳是临床实验室的常规项目，新鲜血清经电泳后可分成白蛋白、α1、α2、β及γ蛋白。血清蛋白电泳图谱可初步了解患者血清蛋白全貌通常用作初筛试验，常用于急性炎症、肝病、肾病和单克隆蛋白增生(M蛋白)的诊断和鉴别诊断。由M蛋白所导至的一组疾病如：多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链病、游离轻链病、半分子病、良性单株丙球血症和双M蛋白血症等，目前该病已不罕见。血清蛋白电泳对这类疾病的早期诊断、疗效观察和预后判断均具有十分重要的意义。它既可采用琼脂糖凝胶电泳，也可使用毛细管电泳，后者自动化程度更高，分离效果更好，受到越来越多的检验工作者的青睐。

图1：血清蛋白电泳图谱

2. 免疫分型 使用毛细管电泳进行免疫分型又称免疫减法，用特异性抗体将待检血清中消除某一个特殊的峰来指示是哪种单克隆成分，借此对单克隆Ig增殖症、本周蛋白、游离轻链、重链的型和亚型进行诊断和鉴别诊断具有十分重要的临床意义，是一种既灵敏又特异的检测手段。如同使用琼脂糖凝胶进行免疫固定电泳用于M蛋白的鉴定与分型。

3. 尿蛋白 与血清蛋白电泳的检测原理相同，碱性缓冲液将尿蛋白分离成5个不同的区带，各区带都包含一种或几种蛋白。尤其是不能进行肾活检时，尿蛋白电泳能确定尿中是否存在异常蛋白，软件可以对电泳图谱自动分区，读测，以筛查肾脏损伤部位（肾小球或肾小管），尿蛋白电泳结果能很好地协助临床医生判断肾脏的主要损害，帮助临床选择适当的治疗方案。但实际开展的临床实验室不多，还是采用SDS-琼脂糖凝胶电泳（SDS-AGE）为主，电泳图谱中蛋白按照分子量大小排列，中、高分子量蛋白区带主要反映肾小球病变；低分子量蛋白区带反映肾小管病变及溢出性蛋白尿；混合性蛋白尿则可见到大、中、小各种分子量区带，示肾小球及肾小管均受累及。非常直观。此外，毛细管电泳仪也能对本周氏蛋白进行鉴定和定量。

4. 血红蛋白(Hb) 血红蛋白病（地中海贫血、镰状细胞贫血、异常血红蛋白病等）是世界上发病率最高、危害最大的单基因遗传病。已被WHO列为严重危害人类健康的六大疾病之一。中国人群中异常Hb、β地贫基因和α地贫突变分别各占70多种、34种和11种，对该病尤以预防为主。血红蛋白电泳是筛查地贫的简便、准确方法，在临床上尤其在我国南方各省广为开展，如婚检、产检、新生儿疾病筛查，该项目发挥着重大的作用。毛细管电泳直接将血红蛋白组分分开，无需进行洗涤红细胞的前处理，自动化操作十分便捷，大大提高了血红蛋白电泳的分离效率。

图2：血红蛋白电泳图谱

5. 糖化血红蛋白（HbA1c) HbA1c是-糖尿病标志物检测的金标准。在美国和欧洲HbA1c已经被公认为糖尿病诊断和长期监控的金标准。于2011年开始，市场上出现了毛细管电泳检测HbA1c技术，它比目前所用的HbA1c检测方法具有更好的分离效果，在使用碱性缓冲液条件下, 正常和异常(或变异体)血红蛋白按下列顺序检测出来,从阴极到阳极依次为A2、C、E、S、D、F、A0、其它血红蛋白以及HbA1c，从而排除血红蛋白变异体对HbA1c检测结果的影响，同时它对HbA2 的定量检测又可用于β地中海贫血的筛查。尤其是能够分离出各种血红蛋白变异体，从而排除血红蛋白变异体对HbA1c检测结果的影响。因此，毛细管电泳开创了HbA1c新一代检测技术。

图 3：糖化血红蛋白电泳图谱

6. 糖缺失转铁蛋白(CDT） CDT(carbohydrate deficiency transferrin)是目前诊断酒精性肝病及评估戒酒效果的最有价值的生物学指标。CDT属于转铁蛋白（Tf）的亚型。根据唾液酸化水平， CAPILLARYS系统中，转铁蛋白按下列顺序检测出来：去唾液酸转铁蛋白（非唾液酸型）、二唾液酸转铁蛋白、三唾液酸转铁蛋白、四唾液酸转铁蛋白和五唾液酸转铁蛋白。低唾液酸异构体（某些情况下，二唾液酸转铁蛋白与去唾液酸转铁蛋白结合在一起）组成缺糖基转铁蛋白(CDT)。毛细管电泳检测CDT正常参考值< 1.3%, 在检测后15天左右CDT检测结果可下降50%，大约4周后恢复正常，所以CDT检测也是酒精中度患者恢复中的最好参考指标。该法对酒精依赖的高危人群进行检测其灵敏度达 85-94% ，特异度达85-100%。

目前，市场上科研型高效毛细管电泳仪以 ABI 3xxx系列及Beckman coulter GeXP 为代表的毛细管电泳在激光诱导荧光的毛细管阵列领域处于领先地位。

1.核酸/基因分析：

（1）核酸序列分析（测序)基于Sanger 法，主要是用连有4 种不同的荧光发色基团（不同的吸收光谱）的ddNTP 终止链的延伸后，在不同波长的激光诱导下有各自的吸收峰，如果把4种不同的吸收峰叠加在同一个图上，就可以根据吸收峰来鉴定相应位置的碱基，得到的序列再转换成模板链。DNA测序是激光诱导荧光毛细管阵列最基础的应用。通过测序，可以对物种进行鉴定、发现基因突变和多态性位点等。

（2）核酸片段分析 只需通过检测PCR产物的大小就可对核酸序列进行判别。主要用于: A. 微卫星分析（STR）生物染色体上存在简单序列的重复结构，这种结构就叫微卫星。通过片段分析可以判断重复碱基的重复数目，从而对生物体进行基因分型，疾病预测、用药指导等。B.可变剪切体检测 有些基因的一个mRNA前体通过不同的剪接方式(选择不同的剪接位点)产生不同的mRNA剪接异构体，通过毛细管电泳的片段分析可将不同mRNA的剪接异构体同时检测出来。C. SNP 分析 是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。通过检测SNP，可以发现不同性状产生的根本原因。

（3）基因定量分析 核酸定量分析主要指染色体拷贝数的变化及mRNA的表达变化分析。常用的方法是realtime PCR，该法灵敏度高，操作简便，但由于荧光通道少，在通量上收到一定的限制。该技术采用通用引物引导多重PCR，然后通过毛细管电泳将多重PCR产物分离的策略来实现多重基因的定量检测。该方法可以实现一孔同时检测30-40个基因，弥补了传统realtime PCR通道不足的局限性，不仅适合进行生物标记物的筛查，还能进行多个基因的相关关系研究。

2. 离子分析: 对阴/阳离子进行定量检测，如啤酒口味的有机酸检测、爆炸物残留物的离子分析、水中三嗪类农药的残留分析、牛奶中三聚氰胺的测定等。

3. 手性分离： 使用单一活性异构体，将HPLC中固定化的手性拆分试剂添加到缓冲液中，在同一根毛细管中实现各种手性分离，是当今制药界的趋势；也是当今中药研究和成分分析的工具，如对铁皮石角中药指纹图谱分析等。

结束语

本世纪以来，随着毛细管涂层技术、温度调节、多通道控制、自动化程度的不断提高，高效毛细管电泳技术及其应用取得了长足的进步和创新。2014年以来，国内部分医院开始利用全自动毛细管电泳进行糖化血红蛋白检测，已经与国外先进技术接轨，为糖尿病的诊断和治疗提供了准确的检测结果，北京卫生部临检中心和上海临检中心将开展糖化血红蛋白室间质评。伴随着毛细管电泳的技术革新，检测重复性大幅提高，高效毛细管电泳有逐渐取代传统生物分子分离技术的趋势。今后，高效毛细管电泳将会在药物浓度监测、基因多态性分析、单细胞分析、微量生物标志物的检测、蛋白亚组分分析等方面得到越来越多的应用。临床实验室专家期望电泳技术进一步提高自动化程度，能够匹配流水线。在检测性能方面，具有更高分辨能力、更大通量、更多检测项目，使该技术能受到越来越多检验工作者的青睐,在我国检验医学领域中发挥其更重要的作用，为检验医学事业的发展发挥更大的功能。