微流控芯片技术应对临床检验医学的挑战

一、微流控与微流控芯片

微流控（Microfluidics）的含义是微尺度下的流体控制，其研究对象是使用微米级通道操控纳升级以下微量液体的系统[1-3]。鉴于芯片是实现微流体控制的主要平台，因而微流控芯片（Microfluidic chip）是微流控的主要研究内容。

微流控芯片的制作主要依托于MEMS（Micro-Electro-Mechanical System）加工工艺，具有在微米尺度级别实现微量流体操控的能力。微流控芯片技术的特点来自于两个方面：一是微流体的特性微尺度下流体的一系列特殊效应包括层流效应、表面张力及毛细效应、快速热传导效应和扩散效应等，这些效应有利于精确流体控制和实现快速反应；二是微加工工艺带来的结构复杂性微加工工艺具有加工小尺寸、高密度微结构的能力，便于实现各种操作单元的灵活组合与规模集成。因此，样品前处理、分离与分析、检测等实验流程得以在同一芯片上集成化和并行化，从而达到微型化、自动化、低消耗和高效率的目的[4,5]。

微流控研究起始于20世纪90年代，至今已经有二十余年的发展历史，其间经历了基础理论奠定、单元操作技术发展、小规模集成和大规模集成几个历史发展阶段。至今，微流控技术已经较为成熟，已经在多个领域得到认可并广为利用,其产业化趋势亦是愈发明显[6]。2003年《福布斯》杂志把这项技术评为“影响人类未来15件最重要发明之一”；2004年，美国Business 2.0杂志封面文章将微流控芯片列为“改变世界”的七种技术之一；2006年Nature杂志出版了一期微流控专辑，题名为“本世纪的技术”。

二、微流控体外诊断技术的优势

体外诊断（In vitro diagnosis, IVD），是指对人体的体液和组织等进行检测而获得临床诊断信息。微流控芯片是体外诊断的有利技术平台[7,8]，这表现在以下几个方面：1.应用场景拓展传统的检验设备多为大型仪器，虽然在测试通量和稳定性上具有优势，但其使用局限于专业实验室。微流控芯片系统体积小巧、操作简单，完全可以在门急诊、基层医疗单位甚至床边进行检测，这极大地拓展了体外诊断的应用空间；2.分析效率的提高集成化和并行化设计的微流控芯片系统，有能力在短时间内提供更为丰富的诊断信息，因而显著提升了分析效率；3.测试成本的下降微流控芯片使用微反应体系，能够大幅降低试样消耗从而降低测试成本[9]。概括来讲，微流控体外诊断技术的优势可以归结为多、快、好、省四个字，这种分析技术无疑是对现有体外诊断技术的巨大提升。

微流控体外诊断技术已经引起了国家层面的重视。2016年国务院“十三五”国家科技创新规划中关于体外诊断产品的章节写到“突破微流控芯片等关键技术，开发全自动核酸检测系统等一批重大产品，研发一批重大疾病早期诊断和精确治疗诊断试剂以及适合基层医疗机构的高精度诊断产品，提升我国体外诊断产业竞争力”。由此可见，微流控体外诊断技术的发展已经上升到国家战略层面。

作者所在研究团队工作于临床检验第一线，课题组的研究方向是针对临床检验中的痛点问题发展创新微流控诊断技术。经历了十余年的研究历程，课题组对于微流控体外诊断技术在临床检验医学中的应用价值逐步加深了理解。本文中就课题组对于微流控技术的理解以及我们的一些体外诊断应用尝试与大家分享，希望能够对检验医学同仁有所帮助。

三、微流控芯片技术在体外诊断领域的应用尝试

当前，传统的体外诊断技术已经极为成熟。微流控体外诊断产品若要进入体外诊断市场，势必要展示出高人一筹的能力。相比较传统的宏观检验设备，微流控产品最大的市场拓展潜力在于：1.针对传统产品无法适用的应用环境开发产品；2.发展性能指标和操作便利性具有明显优势的颠覆性新产品。一个成功的微流控体外诊断产品，需要在操作便利性、分析速度、分析通量和测试成本等几个方面达到平衡。以下，我们就课题组在几个关键的临床检验应用领域的研究工作加以介绍。

（一）分子诊断

分子诊断是新兴的检验医学领域。随着荧光定量PCR的推广，基因检测技术在临床医学中得到了广泛应用。尽管如此，现有核酸分析平台的一些不足之处还是限制了分子诊断技术的推广：1）场地要求严格，试剂准备、核酸提取和扩增需要分别在独立房间内进行，极大限制了该技术在医疗资源有限条件下的开展；2）采用离线式分析，操作复杂、分析周期较长，不利于应对突发性事件；3）现有的荧光定量PCR方法多是针对单一指标检测设计，对于多重基因检测无论是操作繁琐程度还是测试成本均是难以接受的。

分子诊断是微流控芯片技术最具有代表性的应用领域。对于分子诊断应用，微流控芯片最大的贡献在于该技术有潜力将核酸提取、扩增和检测集成于同一装置，因而可摆脱繁琐操作以及对专业实验室的依赖。此外，由于反应过程处于封闭的环境中，可以消除交叉污染的可能性。除了功能集成，微流控核酸分析芯片还需要具有一定的分析通量以满足临床实际需求。已经商业化的微流控分子诊断产品基本都是针对病原微生物检测应用，其价值在于：1.实现现场快速检测；2.解决难于培养鉴定病原（如结核杆菌、病毒、支原体等）鉴定问题。

作者课题组最近发展一种液滴阵列微流控芯片核酸分析系统[10]。这种便携式系统包含机械、磁力和光学检测单元，其设计理念是平衡集成、通量、成本及便携性等关键因素，发展适合于现场应用的病原筛查工具。系统所用微流控芯片上设计有多组以狭缝通道连通的串联微池，全部分析试剂均以油包水形式预存储于其中。由于表面张力效应，油相可以浸润微池和狭缝而水相不能。利用磁铁阵列驱动磁珠在串联液滴中穿行，程序化完成细胞裂解-核酸结合、磁珠洗涤、核酸洗脱、扩增/检测等一系列步骤，从而实现自动化和平行化核酸分析。该系统极为紧凑，适合于现场快速检测及医院门急诊场景下的“随到随检、快速响应”需求。课题组将这一系统用于性传播疾病病原筛查，淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲脲原体、生殖支原体等四种病原的筛查可在45 min内完成。

图1 液滴阵列微流控芯片核酸分析系统。A. 分析仪器实物及结构示意图; B. 分析原理示意图。

（二）免疫检测

免疫检测是临床检验极为重要的领域。目前，临床免疫检测的主流技术是化学发光和免疫比浊法，具有灵敏度高和检测线性范围宽的优势。这些检测方法一般使用大型仪器，分析通量较高。但是，由于购置成本和仪器体积因素，这类设备仅适合于大型实验室使用。基于试纸条的胶体金法是快速免疫检测的主流技术，该技术虽然使用方便，但在灵敏度和线性范围方面受限。因此，临床检验工作需要一种兼具操作便利性、检测灵敏度和定量准确性的免疫检测平台，这对于急诊以及基层医疗单位尤其重要。

图2 液滴阵列微流控芯片免疫分析系统。A. 分析仪器结构示意图;B. 分析原理示意图。

作者课题组发展了一种微流控芯片免疫化学发光分析系统[10]。与前面介绍的液滴阵列微流控芯片核酸分析系统类似，免疫化学发光分析系统采用具有平行串联微池结构的微流控芯片。免疫化学发光分析相关的一组试剂以油包水液滴形式预存储于指定微池中。由于表面张力效应，狭缝可以隔绝水相溶液。通过程序化的磁力操控，在液滴间转移磁珠，从而将化学发光免疫分析涉及的一系列操作，包括抗原-抗体结合、磁珠洗涤、酶促发光及信号检测，在芯片分析系统内自动完成。研究利用发展的微流控化学发光免疫分析方法，进行了C反应蛋白(CRP)与降钙素原(PCT)两种感染性疾病标记物的同步检测。在优化的实验条件下，整个过程可在15 min内完成。CRP与PCT检测限分别为0.31 ng·mL^-1和0.09 ng·mL^-1，标准曲线线性范围分别为0.8-200 ng·mL^-1和0.5-60 ng·mL^-1，对照测试提示微流控芯片系统与商品化仪器检测结果高度一致。

（三）病原微生物检测

病原微生物检测主要包括病原鉴定和药物敏感性判定两个方面。目前，临床微生物检测面临的最大问题就是检测周期过长。感染性疾病大多病情凶险，需要及时诊断和治疗，留给病原检测的时间窗口只有30分钟左右。然而，目前的病原微生物鉴定和药物敏感性判定的典型周期是2-3天，这显然难以满足临床需求。病原检测技术的限制所带来的结果是，一方面经验性诊断的准确性难于保证，另一方面抗生素滥用引发了严重的耐药问题。

微流控技术对于病原微生物鉴定的解决方案多是采用核酸检测策略，这在前面部分已经叙述。鉴于药物敏感性(Antimicrobial Susceptibility Testing, AST) 判定的实质是病原在药物暴露条件下的增殖情况判定，微流控技术采用的策略是：1.通过培养器体积的减小，实现检测信号的相对富集；2.使用更为精准的病原定量技术。这两种策略均可以通过缩短病原培养时间实现快速的药物敏感性判定。遵循这种理念，作者课题组发展了一种基于液滴阵列微流控芯片的数字化抗生素敏感性测试方法[11]。我们的设想是借助于数字化分析的精准定量能力显著缩短细菌培养时间。细菌悬液与抗生素孵育后引入微流控芯片完成液滴发生和捕获，生成高密度微液滴阵列。通过对液滴阵列进行荧光扫描成像，检测每个液滴中的荧光信号并以此计算出细菌存活率（v）和阳性微液滴比例（p）。根据阳性微液滴比例，可以泊松分布算法推算出细菌密度,依据细菌密度变化可确定最小抑菌浓度（minimuminhibitory concentration, MIC）。我们的初步研究结果显示应用该方法仅需30 min抗生素暴露时间即可判定大肠杆菌的抗生素敏感性。

图3A.液滴微流控芯片原理设计图结构包含上游的液滴生成区和下游的液滴捕获区；B.利用液滴荧光成像分辨细菌阳性和阴性液滴；C.液滴数字化分析显示健康人和尿路感染病人尿液细菌计数差别；D.液滴数字化分析显示敏感和耐药细菌对于抗生素的反应。

（四）细胞水平抗肿瘤药物敏感性测试

体外抗肿瘤药物敏感性测试是指导抗肿瘤药物合理使用的有效手段。虽然基因检测可以用来预测抗肿瘤药物敏感性，然而该方法存在一定的不确定性。相比之下，细胞水平的药物测试仍然是判定抗肿瘤药物敏感性更为直接可靠的手段。然而，由于细胞水平抗肿瘤药物敏感性测试存在体内外实验结果差异大、测试通量有限以及操作难于标准化等问题，至今在临床难以推广。

   针对该问题，课题组开发了一套微流控肿瘤微阵列药物测试系统[12]，其核心是一种复合式结构开放式微流控芯片。芯片顶层是开放式储液池，底层是细胞培养池阵列，中间层是纳米孔薄膜。利用纳米孔薄膜不允许液体通过只允许跨膜扩散的特性，将其用做止流阀实现细胞悬液自动分配以及用作扩散屏障仿真血管内皮层。配合移液工作站，这种微流控芯片可以实现药物筛选所包含的长期细胞培养、换液、多药物处理以及细胞存活检测等一系列操作步骤。

研究利用自行设计加工的1010微流控细胞培养阵列芯片，实现了细胞培养阵列构建、长期细胞培养、换液、多药物处理以及细胞存活检测等一系列功能。乳腺癌细胞在持续培养3天后增殖形成了类组织结构。利用开放式微流控组织阵列芯片实现了3因素3水平正交药物组合测试，并依据细胞存活率检测结果筛选出最佳的抗乳腺癌药物组合。研究结果显示这种明微流控芯片能够以高度仿真的组织实现多药组合测试，因而有潜力成为指导肿瘤个体化精准治疗的有力工具。

 图4A.微流控肿瘤微阵列药物测试系统包含一种复合式结构开放式微流控芯片以及移液工作站；B.微流控芯片上肿瘤微环境重建的示意图。3D培养肿瘤细胞模拟肿瘤实质，水凝胶模拟支持和滋养肿瘤细胞的肿瘤基质，纳米孔薄膜扩散屏障模拟血管内皮层；C.微流控芯片上连续三天内MCF-7乳腺癌细胞增殖情况。（Calcein-AM / EthD-1染色，比例尺：200 μm）；D.抗肿瘤药物正交组合测试结果。药物测试包括LO2肝细胞和MCF-7乳腺癌细胞对A.阿霉素，B.紫杉醇和C.顺铂的3因素3水平正交组合药物的反应。

通过上述应用实例，我们将微流控体外诊断技术的优势概括为：1.应用场景的拓展；2.分析效率的提高；3.分析时间的缩短以及4.检测精度的提升。由此可见，微流控芯片是极具优势的体外诊断技术平台。

四、微流控体外诊断技术的机遇与挑战

目前，我国正处于巨大的社会变革过程，一方面国力的增强和科技的进步促进了新技术的发展和推广，另一方面新形势对于体外诊断行业提出了新的要求。体外诊断作为一个高附加值行业，将会在未来相当长的阶段中快速发展，甚至成为国家的支柱产业。随着医疗改革的推进，三级医疗体系将逐渐完善，随之而来的是医疗资源由集中转变变为分散模式。公立医院的改革以及第三方检验机构的兴起，势必会对体外诊断技术提出更高的要求。在这种形势下，微流控技术将会对体外诊断行业的发展提供一个有利的契机。

现实中的微流控技术产业进程仍然是步履艰难。从技术角度来看，微流控体外诊断产品开发涉及多个学科领域，包括医学、生物、化学和工程等。任何一个企业，想要建立这样一个规模的研发队伍都绝非易事。作为微流控系统的核心，微流控芯片的设计、材料选择、表面处理、芯片加工乃至包装保存，都具有一定技术难度。因此，微流控产品的研发难度远远高于传统体外诊断产品。从产业环境角度来看，研究、生产和应用单位的脱节，高端加工技术的欠缺都增加了微流控产品开发的难度。此外，近期实体经济的低迷也导至企业对于这种高技术含量产品研发信心不足。对于微流控体外诊断产品开发，我们认为以下几个方面需要关注：首先是明确的市场定位，相比较传统技术，微流控产品必须在某个应用领域或应用场景下具有突出的优势；其次是前期研究基础。由于微流控产品研发技术门槛较高，缺少扎实的研究基础会增加开发进程的不确定性；再者就是尽量规避技术制约。由于各种条件限制，某些类型芯片可能在一定阶段内不具备量产可行性。因此，我们对于微流控诊断产品开发的建议是：1. 选择恰当的应用对象；2.整合研发资源；3. 开拓创造性的产学研合作模式。

五、结语

总体看来，微流控体外诊断技术的发展前途是光明的，道路是曲折的。无论如何，我们坚信微流控技术是新形势下应对临床检验医学挑战的有力工具，该技术势必会对临床检验能力的提升起到巨大的推动作用。

参考文献：

 [1].  方肇伦,微流控分析芯片发展与展望. 大学化学, 2001，02:1-6.

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 [3]. Whitesides,G.M., The origins and the future of microfluidics. Nature, 2006. 442: 368-373.

 [4].  林炳承, 功能型微流控芯片实验室的高通量和规模集成. 高等学校化学学报, 2004. 25: 121-123.

 [5]. Haeberle,S. and R. Zengerle, Microfluidic platforms for lab-on-a-chip applications. Lab Chip, 2007. 7: 1094-1110.

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 [7].  林炳承，秦建华, 微流控芯片实验室及其应用出口：疾病诊断和药物筛选, 第四届全国微全分析系统学术会议，2007: 大连. 6-7.

 [8].  Schulte,T.H., R.L. Bardell and B.H. Weigl, Microfluidic technologies in clinicaldiagnostics［J］. Clin Chim Acta, 2002. 321: 1-10.

 [9]. Yager,P., et al., Microfluidic diagnostic technologies for global public health［J］. Nature, 2006. 442: 412-418.

[10].  Shu, BW, et al. Active droplet-array (ADA)microfluidics enables multiplexed complex bioassays for point of care testing. Chem. Commun., 2018. 54:2232-2235.

[11]. 梁广铁，杜燕，舒博文，等. 液滴阵列微流控芯片上的数字化抗生素敏感性测试.// 中国化学会，沈阳，东北大学，2017，第十一届全国微全分析系统学术会议，沈阳:2017:1-1.

[12].  Lin D, et al. Orthogonal screening of anticancerdrugs using an open-access microfluidic tissue array system. Anal Chem. 2017; 89(22):11976-11984. 

注：文章有部分内容引用作者在《中华检验医学杂志》待发表综述。