CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，基于成簇间隔短回文重复序列 )作为一种基于RNA的后天免疫防御系统，其间隔序列与噬菌体或质粒序列存在同源性，能利用靶位点特异性的RNA指导Cas蛋白靶向几乎所有生物和细胞中遗传错误的基因。
CRISPR/Cas系统由靶向外源基因组材料特定区域的引导RNA序列（gRNA）和效应Cas（CRISPR相关核酸酶）蛋白组成：
CRISPR/Cas系统是一种非常独特且极具前景的技术，可用于基因编辑和分子诊断，能够通过编程gRNA序列靶向任何基因区域，其在传染病检测中最重要的作用是通过使用Cas蛋白识别病原体和基于核酸的诊断。
Cas蛋白有两大类：仅具有靶标切割活性的Cas9，和在靶标识别时还具有非靶标切割（侧支切割）活性的Cas12、Cas13和Cas14。其中Cas12和Cas13运用较多，分别切割非靶单链DNA（ssDNA）和单链RNA（ssRNA）。
CRISPR/Cas技术在核酸检测中的使用需要前置扩增或后置扩增。通过将CRISPR/Cas技术与PCR或等温扩增，如LAMP、RPA、NASBA和RCA等方法相结合，开发了新一代的分子诊断方法，可以高灵敏度和特异性检测DNA和RNA。
例如：
CRISPR/Cas9联合NASBA技术已成功应用于寨卡病毒检测和谱系识别；CRISPR-Cas9分型PCR（ctPCR）技术是一种前置扩增过程，用于检测HPV亚型；
近期热门的SHERLOCK系统是将Cas13和RPA结合的CRISPR/Cas技术，用于登革热病毒和寨卡病毒等的分子诊断；
Cas14酶与RCA方法结合检测微小RNA（miRNA）和单核苷酸多态性（SNP）；
将CRIPR/Cas与PCR结合的HOLMES；
以及将Cas12与LAMP和RPA方法相结合，用于病原体特异性检测。这种组合技术最初被命名为DNA内切酶靶向CRISPR反式报告子（DETECTR）方法。随着DETECTR方法的发展及其在POC诊断中的应用，越来越多的基于LAMP的CRISPR/Cas技术被运用于病原体的研究。
基于LAMP的CRISPR技术是近年来研发出用于病原体检测的新一代分子诊断技术，这种技术的结合应用消除它们单独使用时存在的限制。
比如说，LAMP虽然有快速扩增的优势，但是很容易出现假阳性的问题。不正确的引物设计、受污染的DNA和未优化的反应体系（如缓冲液pH值、Mg浓度、具有干扰作用的染料）可能导至检测的特异性和灵敏度降低。
而CRISPR/Cas技术使用reporter来检测特异性靶标，可以消除LAMP的局限性，降低假阳性结果的可能，实现高灵敏度和高特异的检测。
结合LAMP的CRISPR/Cas技术可以通过荧光层析纸条或直接肉眼判断检测结果，不需要像其他核酸检测一样进行定量测量，实现高效、灵敏、特异且不需要复杂设备的POC检测。
在CRISPR/Cas联合LAMP技术中，特别优选Cas12核酸内切酶，因为其具有侧支切割活性。Cas12酶有三个分支，分别包括Cas12a、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12b、Cas12h、Cas12i和Cas12g。
在这些亚型中，Cas12a和Cas12b最常用于LAMP-CRISPR检测，其中Cas12a优选。因为 Cas12b需要111个核苷酸的长sgRNA，包含crRNA和tracRNA区域。长sgRNA可能导至与靶标LAMP引物的部分重叠，并可能导至假阳性。而Cas12a酶需要41个核苷酸的短gRNA，这也是最初用来开发DETECTR方法的。
Cas13也有被用于LAMP-CRISPR中的，由于Cas13切割ssRNA，当使用Cas13时，需要额外的T7转录步骤来在预扩增后将DNA扩增子转化为RNA分子。
LAMP-CRISPR/Cas技术已被用于检测各种传染性病毒和细菌（表1）。在许多检测中，这种技术对病原体检测中显示出高达100%的特异性和灵敏度。与金标准qPCR相比，LAMP-CRISPR检测周转时间更短，非常适合用于快速检测。
表1 各种LAMP-CRISPR/Cas应用平台比较
尽管如此,LAMP-CRISPR/Cas也是具有一些局限性的，主要源于这项技术需要两个步骤，即扩增过程和CRISPR/Cas过程。这两个过程具有不同的化学成分和反应条件。LAMP扩增中使用的Bst酶反应温度在60-65度，而CRISPR反应的Cas酶在37度左右，整个反应需要两个不同的温度。使用两种不同的反应过程和反应体系可能会增加污染风险。
目前，也有解决办法可以克服这个局限性，比如说，在HOLMESv2检测中，通过使用嗜热Cas12b（从嗜酸芽孢杆菌中分离）实现单管反应，解决不同反应温度的问题。
也有的为了最大限度地降低对操作人员的技术需求和污染风险，通过在反应试管底部用油密封LAMP试剂，把CRISPR试剂反应管盖上来实现单管反应。LAMP扩增后，将试管倒置混合启动CRISPR/Cas12a过程。
CRISPR/Cas技术也可以与PCR和其他等温方法相结合，如NASBA、RCA和RPA,但是都具有一定局限性。
比如说由于需要用于热循环的复杂设备，PCR在POC诊断平台中不是优选的。
与LAMP类似，其他等温扩增方法也不需要复杂的设备，不过它们通常需要两个引物、两种或多种酶。例如，NASBA需要使用三种酶来扩增RNA或单链DNA，此外与其他方法相比，CRISPR和NASBA组合的灵敏度较低。相比之下，LAMP技术通过使用单一的Bst酶成本和操作复杂性更低。并且LAMP通过使用多个引物提供了更高的特异性和更高的效率。
RPA虽然用的也较多，不过RPA需要最后一步将扩增产物转化为RNA分子，因此，它经常与Cas13酶结合使用,它最主要的优势是RPA反应的温度跟CRISPR反应温度接近，但是最大局限性是和CRISPR扩增的产物浓度较低。它在靶标浓度低的时候灵敏度不如LAMP好。当使用CRISPR组合LAMP时，可以获得高浓度的扩增产物。因此，LAMP优于其他等温方法更被优于选择与CRISPR技术结合使用在POC诊断平台中。
受LAMP技术在POC平台中的启发，LAMP-CRISPR POC设备通常依赖于三个阶段的实验过程：
在单管中实现这三个步骤可最大限度地提高用户便利性，目前已有几种POC平台取得了成功。基本原理是将LAMP和CRISPR/Cas反应集成在微流控芯片上进行，然后通过荧光检测或者测流层析读取结果。
例如一个便携式POC仪器采用可充电半自动设备，尺寸只有3.5cmX3cmX13cm大小，可用于移动实验室、机场和检疫区。它有个可改变温度的按钮，以确保RT-LAMP扩增在65℃和CRISPR/Cas12a在37℃进行。一次可在35分钟内检测10个样品，然后通过层析试纸通过肉眼检测结果。
CRISPR试纸👇
总体来说，开发LAMP-CRISPR/Cas的POC检测，简化样本处理和核酸裂解步骤，实现全过程的自动化，对提高样本周转时间和使用便捷度是关键。
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