IVD开发笔记丨 SMA检测试剂盒

这里是

开发步骤

1.市场调研和需求分析

首先进行市场调研，了解现有的SMA检测产品以及市场需求。收集相关的检测方法、试剂盒性能指标等信息，明确产品开发目标和技术路线。

2.设计试剂盒

基于PCR技术开发SMA检测试剂盒，主要包括：

a.选择合适的引物和探针，针对SMA病关联基因SMN1和SMN2的特定区域设计引物和探针序列。

b. 优化PCR反应体系，包括选择合适的PCR酶、Buffer体系、引物浓度、探针浓度等。

c. 设计质控标准品，包括阳性质控、阴性质控以及内参质控。

3.试剂盒验证

对试剂盒进行验证，包括敏感性、特异性、重复性、稳定性等方面的评估。验证试剂盒在不同样本类型（如血液、唾液等）中的性能。

4.符合法规要求

确保试剂盒符合NMPA的注册标准，遵循相关的法规和指南。准备相应的技术文件，如操作手册、性能说明书等。

5.临床试验

开展临床试验，收集数据以证明试剂盒的安全性和有效性。与临床试验机构合作，确保试验的质量和合规性。

6.NMPA注册

完成上述步骤后，向NMPA提交试剂盒的注册申请，提供相应的技术文件、临床试验数据等。与NMPA进行沟通，回应问题，以确保产品获得批准。

7.试剂盒生产和销售

在获得NMPA批准后，进行试剂盒的生产和销售。持续关注市场反馈，优化产品设计和生产流程，确保产品质量。

开发背景

1.SMA简介

脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy，简称SMA）是一种遗传性的神经肌肉疾病，导至肌肉变得虚弱和萎缩。在活产婴中发病率为 1/10000～1/6000，人群携带率为 1/60～1/40，是仅次于囊性纤维增生的儿童第二大致死性遗传病。SMA患者在脊髓中失去了一种控制肌肉运动的神经细胞（称为运动神经元）。没有这些运动神经元，肌肉就无法接收使肌肉运动的神经信号。是一种由5号染色体上的SMN1基因突变导至的遗传性神经肌肉疾病，主要表现为脊髓前角细胞和脑干运动核的退行性变，导至近端肌肉无力和萎缩。SMA分为不同的临床类型，根据发病年龄、严重程度和存活期，可分为0型、I型、II型、III型和IV型。SMA的诊断主要依靠临床表现、家族史、肌电图和基因检测。

2.现有的SMA检测产品

• Genzyme公司生产的SMA Carrier Screening Assay

• MRC-Holland公司生产的SALSA MLPA Probemix P021 SMA

• Asuragen公司生产的AmplideX® SMA Plus Kit

• Randox Laboratories公司生产的Spinal Muscular Atrophy (SMA) Array

3.市场需求

• 早期筛查：新生儿、孕妇以及家族病史中存在SMA的高危人群

• 家族遗传风险评估：SMA患者家庭成员的遗传风险评估

• 临床诊断：疑似SMA患者的确诊

• 用于药物治疗和疗效监测的检测方法

4.检测方法

• 实时荧光定量PCR（qPCR）：可用于检测SMN1和SMN2基因的拷贝数变异

• 多重连接依赖性探针扩增（MLPA）：可用于检测基因重排、缺失和重复

• 基因测序：用于检测基因突变、插入和缺失

• 微阵列技术：用于全基因组水平的基因拷贝数变异检测

检测试剂盒开发方案

3.1 开发基础

 SMA 的基因检测主要目的是确定 SMN1 基因的缺失或突变，以及 SMN2 基因的拷贝数，从而诊断 SMA 的类型和严重程度。目前，有多种技术可以用于 SMA 的基因检测，包括 PCR、MLPA、NGS 等。不同技术有各自的优缺点，例如灵敏度、特异性、成本、时间等。

开发 SMA 检测试剂盒需要考虑以下几个方面：

• 目标人群：检测试剂盒应该适用于不同年龄段、临床类型和遗传背景的 SMA 患者或携带者。

• 样本类型：检测试剂盒应该能够使用常见且易于获取的样本类型，如血液、唾液等。

• 技术平台：检测试剂盒应该选择合适的技术平台，以保证准确性、稳定性和可重复性。

• 分析方法：检测试剂盒应该提供有效的分析方法，以解读 SMN1 和 SMN2 的序列变异和拷贝数变异，并给出相应的诊断结论。

• 质量控制：检测试剂盒应该通过严格的质量控制程序，以确保结果的可靠性和一致性。

• 评价标准：检测试剂盒应该通过相关的评价标准，如敏感度、特异度、准确度等，以证明其有效性和优越性。

3.2 基于 PCR 的 SMA 检测试剂盒

基于 PCR 开发 SMA 检测试剂盒是指利用 PCR 技术对 SMN1 和 SMN2 基因的拷贝数和序列变异进行检测的方法。PCR 是一种能够在体外快速扩增特定 DNA 片段的技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简便、成本低等优点。PCR 可以使用血液或唾液等样本进行 SMA 的诊断或携带者筛查，也可以使用干血斑 (DBS) 进行新生儿筛查 (SMA-NBS)。

目前，有多种基于 PCR 的 SMA 检测试剂盒已经开发出来，例如：

• AmplideX PCR/CE SMN1/2 Plus Kit: 这是一个基于毛细管电泳 (CE) 的检测试剂盒，可以同时检测 SMN1 和 SMN2 的拷贝数和序列变异。这个检测试剂盒可以提供全面的结果，在四个小时内完成分析，并且有专门的软件自动化结果解读。

• Novel SMA Screening Method Uses PCR With High-Resolution Melting: 这是一个基于高分辨率熔解曲线分析 (HRM) 的检测试剂盒，可以快速地区分 SMN1 和 SMN2 以及它们的拷贝数。这个检测试剂盒具有高通量和高效率的优势，适合大规模筛查。

• Development of a multiplex real-time PCR assay for the newborn screening of SCID, SMA and XLA: 这是一个基于实时荧光定量 PCR (qPCR) 的检测试剂盒，可以同时检测三种遗传病：严重联合免疫缺陷症 (SCID)、X-连锁无球蛋白血症 (XLA) 和 SMA。这个检测试剂盒使用干血斑作为样本，可以在一次反应中得到三种疾病的结果。

3.3 设计引物探针序列

SMN1 和 SMN2 引物探针序列是指用于 PCR 技术检测 SMN1 和 SMN2 基因的拷贝数和序列变异的特异性核酸片段。由于 SMN1 和 SMN2 之间有高度的序列同源性，设计引物探针序列需要考虑以下几个因素：

• 引物探针序列应该能够区分 SMN1 和 SMN2，避免发生非特异性扩增或杂交。

• 引物探针序列应该能够覆盖 SMN1 和 SMN2 的关键区域，如外显子 7、内含子 7 等。

• 引物探针序列应该能够适应不同的 PCR 技术平台，如 CE、HRM、qPCR 等。

• 引物探针序列应该能够保证 PCR 反应的效率和稳定性，避免发生二级结构或引物二聚体。

以下给出两种引物探针序列做参考，未经实验验证：

• 使用两对引物和两种荧光标记的探针，分别靶向 SMN1 和 SMN2 的外显子 7 区域。其中一个引物和一个探针包含了 c.840C>T 的差异位点，从而实现了对两个基因的区分。引物探针序列如下：

        SMN1-F: GAGGAGTGGCTTTTCTTTGATG
        SMN1-R: CACCTCCAAAGAATTATTCTTCAT

        SMN1-P: FAM-TGGTGTTTCACTTCAGACCC-BHQ
        SMN2-F: GAGGAGTGGCTTTTCTTTGATG
        SMN2-R: CACCTCCAAAGAATTATTCTTCAT
        SMN2-P: HEX-TGGTGTTTCAC TTCAGACCA-BHQ

• 使用了一对共同引物和一种 SYTO9 荧光染料，靶向 SMN1 和 SMN2 的外显子 7 区域。由于 c.840C>T 的差异位点会影响 DNA 的熔解温度，通过 HRM 分析可以实现对两个基因的区分。引物序列如下：

        Fwd: AGCACCACCACCACCACCAC
        Rev: TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGC

SMA 治疗药物现阶段情况

这里是另一篇笔记的内容，一直在思考非传染的疾病检测，如果确诊了没药吃也那么诊断的意义在哪里？当然这里也是给检测试剂盒一个思路，阅微基因的MSI和正大天晴的PD1/PDL1听说也卖的挺好的。

SMA 治疗药物是指针对 SMA 的病因或症状进行治疗的药物。SMA 是由于 SMN1 基因的缺失或突变导至 SMN 蛋白质的缺乏，从而引起运动神经元的退化和死亡，导至肌肉无力和萎缩的遗传性神经肌肉疾病。

4.1 FDA批准治疗药物

• 纳索尼生 (Spinraza): 这是一种基于核酸的药物，通过注射给予，可以改变 SMN2 基因的剪接方式，增加全长 SMN 蛋白质的产生。这种药物适用于各种类型和年龄段的 SMA 患者，可以改善患者的运动功能和生存期。

• 奥纳塞姆诺基因阿贝帕维克 (Zolgensma): 这是一种基于基因治疗的药物，通过静脉注射给予，可以向患者体内传递一个正常的 SMN1 基因，并在细胞内持续表达 SMN 蛋白质。这种药物适用于 2 岁以下的 SMA 患儿，可以提高患儿存活无永久呼吸机支持率和达到发育里程碑率。

• 瑞斯迪平 (Evrysdi): 这是一种小分子化合物类药物，通过口服给予，可以提高 SMN2 基因产生全长 SMN 蛋白质的效率。这种药物适用于 2 个月以上不同类型和严重程度的 SMA 患者，可以改善患者的运动能力和呼吸功能。

4.2 进入临床试验的 SMA 治疗药物

• SRK-015: 这是一种全人源单克隆抗体，可以特异性地结合并抑制促肌肉生长因子 (myostatin) 的活化，从而增加肌肉质量和强度。这种药物已经完成了 II 期临床试验，并计划进行 III 期临床试验。

• RO7204239: 这是一种基于核酸的药物，可以通过注射给予，可以提高 SMN2 基因产生全长 SMN 蛋白质的效率。这种药物已经完成了 I/II 期临床试验，并计划进行 II/III 期临床试验。

• BIIB110: 这是一种小分子化合物类药物，可以通过口服给予，可以提高 SMN2 基因产生全长 SMN 蛋白质的效率。这种药物已经完成了 I 期临床试验，并计划进行 II 期临床试验。

• NMD670: 这是一种小分子化合物类药物，可以通过口服给予，可以提高 SMN2 基因产生全长 SMN 蛋白质的效率。这种药物目前处于评价阶段，并计划进行 I 期临床试验。

4.3 SMA 治疗药物开发流程

• 发现阶段：在这个阶段，研究人员通过不同的方法，如基因治疗、核酸治疗、小分子化合物等，寻找能够增加 SMN 蛋白质水平或改善 SMA 症状的潜在药物候选物。

• 优化阶段：在这个阶段，研究人员通过对药物候选物进行结构修饰、筛选、评估等，优化其活性、选择性、稳定性、安全性等属性，以提高其进入临床试验的可能性。

• 评价阶段：在这个阶段，研究人员通过对药物候选物进行体外和体内实验，评价其对 SMA 的治疗效果和毒副作用，并确定其最佳给药方式和剂量范围。

• 注册阶段：在这个阶段，研究人员通过向相关机构申请并获得批准后，进行临床试验，验证药物候选物对不同类型和年龄段的 SMA 患者的安全性和有效性，并收集相关数据以支持上市申请。