PCR荧光探针法（Real-Time PCR）

幸福侠侣

（一）
简介
Real-Time PCR 技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行走量分析或通过Ct值对模板进行相对定量。
定量PCR已经从基于凝胶的低通量分析发展到高通量的荧光分析技术，即实时定量PCR。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。



主要应用

• DNA 或RNA 的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等
• 基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等 )，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证
• 基因分型：例如SNP 检测，甲基化检测等
  

常用方法Sybr green（荧光染料掺入法） 和Taqman probe （探针法）
SYBR green:
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。适用性和特点：
1、灵敏度高：使用SYBR可使荧光效果增强到1000倍以上
2、通用性好,不需要设计探针,方法简便,省时,价格低廉。
3、通用型方法，在国内外科研中普遍使用。
4、高通量大规模的定量PCR检测
5、专一性要求不高的定量PCR检测。

Taqman Probe:
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

适用性和特点：
1、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好，特异性更高。
2、适用于扩增序列专一的体系的检测。
3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。
4、靶基因的特异序列较短，无论怎样优化引物设计条件都不能解决。
5、存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。
6、广泛用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物制品的鉴定。


（二）
荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标Molecular Beacon。

    广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号（就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光）。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性（此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响）就会将切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。

　　（请注意，该图显示的不是普通的Taqman探针法，而是Taqman MGB探针法）Taqman探针检测的是积累荧光。常用的荧光基团有FAM，TET，VIC，HEX等等。当探针完整的时候，由于3′端的荧光淬灭基团在吸收5′端报告基团所发射的荧光能量，本身会发射波长不同的荧光而导致本底高，因此TaqMan探针近来又有新的发展——TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高——因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。

    Taqman探针法已经得到广泛使用，不过有人认为这种技术利用了Taq酶5`—3`外切酶活性，一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq酶5`—3`外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度(Tm)仅要求其高于60°C，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，难于做质控检测。

（三）

　　实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR）是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied biosystems公司推出，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”,最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA（orcDNA）的起始浓度进行定量的方法。实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA（或cDNA）拷贝数最敏感、最准确的方法。如果用于RNA检测，这被称为逆转录实时PCR即（Real-time RT-PCR）是实时PCR法，它是指对DNA或经过反转入（RT-PCR）的RNA通过聚合酶链式反应并实时监测DNA的放大过程，在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异DNA（RNA）起始量存在相关性，从而实现定量检测。RealTime PCR的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸，从而可通过监测CT值而实现对原始目标基因的含量定量。实时荧光定量PCR法最大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点。此外，通过在该体系中加入两条或者两条以上引物及对应的探针，便可实现对多种病原体的同时检测，如硕世公司的手足口及流感的三重检测。因此荧光PCR技术在医学临床检验及临床医学研究方面发挥着越来越重要的作用。

　　实时定量PCR的系统构成及工作原理

　　荧光定量检测系统由实时荧光定量PCR仪，实时荧光定量试剂，通用电脑，自动分析软件等构成。设备由荧光定量系统和计算机组成，用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平，这就是分析荧光数据的水平。样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值（限制点的循环数）。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大，这样可以获得最准确，可重复性的数据。如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品，线性回归分析将产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。

　　所谓Real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

　　PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。在real-timeQ-PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在real-timeQ-PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个域值（threshold）是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号（baseline），荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数（Ct）。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

　　实时荧光定量PCR技术的应用领域

　　实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以对DNA、RNA样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外我们还可以对PCR产物或样品进行定性分析：例如利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体，以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及SNP检测等。目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面：

　　DNA或RNA的绝对定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。

　　基因表达差异分析。例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异（如药物处理、物理处理、化学处理等），特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA或差显结果的确证。

　　基因分型。例如SNP检测，甲基化检测等。

　　实时荧光定量PCR技术在医疗方面的应用

　　病原体检测：目前，采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、肝炎病毒、结核杆菌、细小病毒B19、EB病毒和人巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。

　　遗传及优生优育诊断：到目前为止，人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA,用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。例外还可以通过实时荧光定量PCR对孕妇弓形虫，梅毒等检测，这对找出不明原因流产和习惯性流产的病因提供有力的帮助，大大提高优生优育。

　　指导治疗：对病原体定量分析显示：病原体量与某些药物的疗效关系。如HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感，而HCV低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗过程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，随后若再度上升或超出以前水平，则提示病毒发生变异等。

　　肿瘤基因检测：尽管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。p53癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。随着与肿瘤相关的新基因的不断发现，荧光定量PCR技术将会在肿瘤的研究中发挥更大的作用。

　　免疫方面检测：通过荧光定量PCR检测出B27,HLA等来帮助诊断免疫性疾病，如强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、器官移植排异反应等。