二代测序，新年新总结

千姿百态

生物通报道：自从哈佛大学遗传学家George Church和454 Life Sciences公司Jonathan Rothberg掀起二代测序NGS的革命以来，已经过去了将近十年。毫不夸张地说，这段时间以来NGS技术已经发生了翻天覆地的变化，在测序通量突飞猛进的同时，测序成本直线下降。  想当年454 Life Sciences公司测序580-kb的细菌基因组，需要四小时的工作循环。而今年一月份Illumina公司发布的HiSeq X™ Ten测序系统，能够以千元成本测序完整的人类基因组，最多每天能测序600 billion bp。（详见：Nature解读：千元基因组真的来了？）如今，二代测序技术给生命科学领域带来了彻底的改变。而NGS领域本身也在经历着某种意义上的变革。正因如此，基因组学Archon X奖（Archon Genomics X Prize）不得不于去年八月宣布取消，因为测序成本的直线下降已经使竞赛变得毫无意义。  Church的团队是该竞赛仅有的两只报名队伍之一，他认为参赛者们是否能够完成竞赛任务还很难预料。但无论如何，既然竞赛已经启动，总得让人家比完吧。言归正传，二代测序领域的2013年既忙碌又喧嚣，在开年之际让我们对这一领域发生的最新进展做个小结吧。 454 Life Sciences去年十月，454 Life Sciences宣布将于2016年中旬逐步淘汰其焦磷酸测序仪器，GS Junior和GS FLX+。据该公司介绍，从扩展性和成本角度看，454平台作为首个商业化的NGS系统已经基本上走到尽头，很难再对其进行升级和改良。Roche的Beth Button指出，公司正在寻求新的测序合作伙伴。2013年9月，该公司宣布与昔日的竞争对手Pacific Biosciences合作，拟基于PacBio公司的SMRT技术进行诊断产品的开发。 Illumina今年一月Illumina公司发布了两个以Solexa测序技术为基础的新测序平台，HiSeq X Ten和NextSeq™ 500。  据该公司的新闻稿介绍，定价$250,000的台式NextSeq 500兼具了样品制备和测序功能。“它按钮式的操作，可以在许多常见测序应用之间切换。该系统能够在一天内测序整个人类基因组和多达16个外显子组。”NextSeq 500运行75个测序循环只需12小时。HiSeqX Ten系统以10台仪器为单位销售，据称可以实现千元成本的人类基因组测序。该系统现定价1000万美元，能够在三天时间内生成1.8 terabases的数据，相当于每天约600 Gb，比HiSeq 2500强十倍。 华盛顿大学的Elaine Mardis表示，HiSeqX Ten系统针对的应该是提供人类基因组测序的服务产业，因为很少有研究机构能用到如此高的通量。“要想实现千元成本，就需要正确的样本量，”她说。当然，高通量还意味着更为复杂的数据分析。Mardis的团队曾作过计算，为了跟上HiSeqX Ten他们可能需要花费八百万美元在信息学设施上。此外，实现千元成本意味着每年需要测序18,000到20,000个基因组。“我要测序许多肿瘤基因组，”她说。“但数量还远远不够。Life Technologies已被Thermo Fisher收购的Life Technologies拥有两款NGS平台，SOLiD和Ion Torrent。据Thermo 的Andy Felton介绍，公司已经将工作的重心放在后者身上。“绝大多数研发工作已经转移到Ion上，”他说。 目前的Ion PGM系统可使用最新的Ion 318芯片，产出多达6 million 400bp的读取，也就是说四小时运行的产量能达到2 Gb。而新Ion Proton™使用Ion PI™芯片，能够产出80 million 200 bp的读取，即每次运行产量达到10 Gb至14 Gb。据介绍，今年公司将会推出用于转录组测序的新Ion PII芯片，每张这样的芯片可产出300 million 100bp的读取，随着系统改良甚至可能达到200bp。
此外，Life Technologies公司正在研发一种新的聚合酶，Hi-Q。据Felton 介绍，Hi-Q能“显著提高精确性”，减少90%的插入/缺失误差。这种酶将于今年的中旬实现全面商业化



Pacific Biosciences  
Pacific Biosciences公司以长读取的二代测序技术著称。据该公司的创始人Steve Turner介绍，在新测序化学P5-C3的帮助下，如今PacificBio的测序读长已经达到了8.5kb。P5-C3“提供了一个保护性的支架”，可以阻止酶和荧光团之间发生身体接触，避免酶受到潜在的光学损伤。
“我们已经很大程度上减少了系统中的光学损伤，我们相信现在测序读长受到的限制，只来自于样品本身，”Turner说。 样品本身的限制是指，读长越长就越难生成不含损伤位点或缺口的测序模板，而这样的缺口会导致测序过早中止
目前PacBio® RS II和SMRT Cell系统，每次运行可产出50,000个读取（约400 million bp）。这一数字会在接下来的一年中继续增涨，Turner说。“我们预计在2014年内，令测序读长再增加50%，并于2015年达到20,000bp。”
最近研究人员发表文章向人们展示，在新装配方法HGAP的帮助下（hierarchical genome-assembly process），可以实现只利用PacBio化学法对真核基因组进行从头装配。一月份，该公司公布了对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）进行的完整二倍体基因组装配，生成了长达24.6 Mb的重叠群（contigs），N50值为15.2 Mb（N50值反映了重叠群的长度）。就在上周，PacBio公司又公布了一个54x覆盖度的单倍体人类基因组装配，生成了“3.25 Gb的基因组装配，重叠群N50值为4.38 Mb，其中最长的重叠群达到44 Mb。

Oxford Nanopore
Oxford Nanopore公司无疑是纳米孔测序的领导者，这一技术也被称为第三代测序。该公司去年十月份宣布，将在2014年年初推出USB大小的MinION™测序仪，为客户提供先期体验（early-access）。
与其他类似先期体验项目不同的是，Oxford Nanopore公司不会局限于传统的测序中心，而是向广大的个人用户敞开大门。该公司准备在接下来的一周发出邀请。
Oxford Nanopore公司强调，不是每个MinION Access Program（MAP）申请者都会在第一轮受到邀请，而且公司提供的MinION数量也可能少于申请者的要求。这些仪器将在六周内进行发送。
2012年，Oxford Nanopore公司在AGBT上描述了两个测序系统，MinION就是其中之一，另一个产品是GridION™。据公司发言人称，MinION的大小使其更容易受到人们的关注，它的灵活性和测序能力将推动NGS进一步迈向普罗大众。  
Oxford Nanopore公司希望通过MinION Access Program评估测序系统的实用性、对不同应用的适应性、数据分析、以及公司的物流运输和试剂分配等。这些数据将有助于未来开展的GridION先期体验项目，不过该公司还未公布这一项目的具体启动时间。

广泛的应用前景
在二代测序技术不断进步的同时，它的应用也越来越广泛。据Mardis介绍，二代测序在临床领域的应用快速增涨。越来越多的研究者选择二代测序的多基因panel对肿瘤进行研究，或者通过外显子测序鉴定潜在的药物靶点。在诊断儿童遗传学疾病时，人们也逐渐抛开了传统的诊断方法，转而使用全外显子组测序。
Mardis补充到，NGS检测有两大优势，它既可以帮助人们确定治疗方案，也可以为患儿父母评估他们未来子女患同样疾病的风险。实际上Church认为，用二代测序进行（致病基因）携带者筛查，是NGS的“杀手锏”。
“任何考虑使用辅助生殖手段的人…都应当知道精子捐献者是否携带与严重疾病有关的隐性等位基因，”他说。“人们已经发现了数百个能够预测疾病的基因，现在也有不少服务可以对它们进行准确的检测。”
最近，Church作为共同作者发表了一项新研究。据他介绍，这是首次发表用NGS进行携带者筛查的文章，他们的方法“充分提高了质量并且降低了成本”。研究团队使用padlock探针，在194个细胞系中抽出并测序了15个有临床意义的基因，其中55个细胞系来自于携带上述基因突变的个体。

二代测序的另一个新兴的应用领域是单细胞RNA测序。“单细胞RNA测序能向我们展示，相同细胞中RNA表达的天然随机性，这一点非常吸引人。” Mardis说。
Church介绍到，他即将发表的一篇文章描述了一种新的测序方案，称为荧光原位测序（fluorescent in situ sequencing）。这一技术将荧光原位杂交和RNA-Seq结合起来，能够计数并确定不同转录本在组织切片中的空间定位。  
Church的团队通过荧光原位测序证实，转录本会依据伤口的愈合情况在成纤维细胞中呈不对称分布。（Science禁止透露进一步的细节）
这样的数据在十年前简直难以想象。同样，我们也很难想象NGS在未来十年又会发生怎样的翻天覆地的变化。

参考文献
[1] Margulies, M, et al., “Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors,” Nature, 437:376–80, 2005. [PubMed ID: 16056220]
[2] Chin, CS, et al., “Nonhybrid, finished microbial genome assemblies from long-read SMRT sequencing data,” Nat Meth, 10:563–9, 2013. [PubMed ID: 23644548]  
[3] Umbarger, MA, et al., “Next-generation carrier screening,” Genet Med, published online June 13, 2013. [PubMed ID: 23765052]
（Jeffrey M. Perkel撰写/