《自然-方法》：2014年值得关注的技术

千姿百态

2014年首刊，《Nature Methods》杂志将2013年度技术（Method of the Year 2013）授予了单细胞测序（single-cell sequencing）。同时，杂志还介绍了2014年值得关注的技术，包括CRISPR和基因组编辑、原位测序、迷你胞内探针、单粒子低温电子显微镜等。

单细胞测序

近几年来，基于单细胞测序技术的科学研究取得了突飞猛进的发展，其成果有望为一些重要的医学问题提供新的解决方案。文章总结了2013年单细胞测序技术对于人类早期发育、癌症以及神经科学研究等几个重点领域的最新应用成果。文章特别指出，来自中国北京大学的一些研究团队在这方面完成了许多优秀的工作，做出了突出的贡献。

单细胞基因组扩增新技术（MALBAC）最早由哈佛大学谢晓亮教授发明，相关论文2012年发表于《科学》 （Science）杂志。该方法通过形成闭合环来抑制DNA片段被重复地复制，以保持DNA扩增的均匀性，解决了传统方法对单细胞基因组扩增的强烈偏好性的问题。这项突破在单个细胞水平实现了全基因组93%的高覆盖率，同时也能准确检测单个肿瘤细胞中的染色体拷贝数异常。

2013年是单细胞基因组学突飞猛进的一年。由谢晓亮教授创建的北京大学生物动态光学成像中心（BIOPIC）在这一领域做出了重要贡献。2013年谢晓亮教授哈佛大学课题组与北京大学BIOPIC李瑞强研究员小组合作，将MALBAC技术应用于人类单个精子基因组的测序研究中。他们对一个亚洲男性的99个精子进行了单细胞全基因组DNA扩增，并且利用高通量测序技术对每个精子分别进行了一倍深度的测序。这项工作首次实现了高覆盖度的单个精子的全基因组测序，构建了高精度的男性个人遗传图谱，相关论文发表在《科学》杂志上。

美国科学院院士、斯坦福大学教授Stephen Quake评价说：“从PCR技术被发明的那天起，人们就在尝试将其应用于分析单个细胞的基因组和转录组，但是直到今天单细胞测序才开始迅速发展。”

单细胞检测技术在癌症研究中也开始发挥重要的作用。2013年12月， BIOPIC白凡研究员和谢晓亮教授团队与北京大学肿瘤医院的王洁教授团队合作共同在《美国科学院院刊》（PNAS）上发表文章，对于癌症病人单个外周血循环肿瘤细胞（CTC）的全基因组、外显子组进行了高通量测序，发现在某一类肺癌患者的所有循环肿瘤细胞中存在着一种特定的基因拷贝数变异（CNV）模式，而不同癌种CTC细胞的基因组拷贝数变异模式不同，为癌症的早期诊断提供了全新的契机。这也是国际上首次实现对外周血循环肿瘤细胞基因组的高通量测序，标志着利用循环肿瘤细胞基因组测序信息进行肿瘤无创诊断时代的到来。

由于人类早期胚胎中的细胞数目非常稀少而且很难获得，所以单细胞测序技术无疑对早期胚胎发育研究有着无可替代的重要意义。2013年12月，谢晓亮教授BIOPIC小组和汤富酬研究员小组以及北医三院的乔杰教授小组共同在《细胞》（Cell）上发表文章，对人类单个卵细胞进行了高精度全基因组测序研究。该研究首次详细描绘了人类单个卵子的基因组，建立了人类女性的个人遗传图谱。这一工作可以有效地帮助接受辅助生殖的女性同时检测并排除染色体数目异常的胚胎以及携带单基因突变的胚胎，从而在大幅度提高辅助生殖成功率的同时、降低严重先天性遗传缺陷婴儿的出生率，提高人口素质。目前，该研究团队正在尝试将这项技术应用于胚胎植入前遗传学诊断的临床试验中，获益于这一技术的第一个婴儿将在2014年出生，为这一技术途径的广泛应用带来了希望。

2013年，汤富酬研究组、李瑞强研究组与北医三院的乔杰教授合作，利用单细胞转录组测序技术，分析了不同时期的人类早期胚胎细胞的基因表达情况，这一研究发现了两千多个全新的可能参与早期胚胎基因表达调控的长非编码RNA。该项工作发表在《自然—结构与分子生物学》杂志上。基因的表达模式与DNA 的表观修饰有着密切的关系，因此，单细胞的DNA甲基化组分析可以用于研究癌症细胞的特异性机理，但是此前的标准方法只能做到同时分析50-100个细胞。而同样也在2013年，汤富酬课题组首次成功实现了单个细胞DNA甲基化组的测序分析。

表观遗传学专家Wolf Reik对单细胞测序分析的意义做出了充分肯定，他在2013年单细胞大会上说：“我之前还不是单细胞团队中的一员，但是我很高兴看到各个领域被单细胞技术推动的如此之快，有了新的技术，我们将会解决更加激动人心的生物学问题”。

文章指出，单细胞测序技术仍然在快速发展过程中，相信不久的将来将出现新一代更好的技术。科学家们期待在新技术的推动下，癌症、生殖发育、神经科学、免疫等领域能够有所突破。

CRISPR和基因组编辑

早在两年前，《Nature Methods》就将年度技术颁给了基因组编辑技术，理由是这种技术能通过在某些物种基因组中进行靶向特异性的突变，从而解答并提出更多精确的生物学问题。CRISPR（规律成簇的间隔短回文重复）无疑是这一领域的新生力量，也再次掀起了基因组编辑的热潮。

向导RNA/Cas9核酸酶复合物克服了以往工具的某些限制。向导RNA很容易设计，让Cas9蛋白靶定基因组中几乎任何想要的区域。Cas9作为核酸酶或切口酶，在DNA上诱导断裂，随后用于基因敲除、标签插入或基因替换。事实上，Cas9的潜力远远不止DNA切割。

在《Nature Methods》10月刊上，哈佛大学的研究人员发表文章称，作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶是目前已知的第一个统一因子（unifying factor），能够共定位RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。1 在他们看来，这种工具有望扩展，在复杂的表观基因组上引入定制变化。

两个研究小组最近也利用更为成熟的TALE来修饰表观基因组。霍华德•休斯医学研究所的Bradley Bernstein及其同事就利用去甲基化酶/去乙酰化酶复合物来靶定增强子中的组蛋白标记，以探索它们在转录中的作用。2 而麻省理工学院的Feng Zhang博士则将TALE与光诱导系统相融合，来靶定组蛋白修饰酶，以改变表观遗传修饰。3

尽管这些方法很有前途，但TALE的定位比CRISPR/Cas9系统更为繁琐。将Cas9与任何选定的酶相融合，我们不仅可改变组蛋白修饰，从而改变染色质状态，还能影响DNA甲基化，实现全新的细胞功能调控。

然而，CRISPR/Cas9系统的特异性仍存在问题。向导RNA序列比ZFN或TALEN所靶定的大部分序列更短，这意味着脱靶效应的几率更高。近期发表的一些文章也证明了脱靶效应是真实存在的。

《Nature Methods》编辑Nicole Rusk认为，CRISPR是否能被精心打造成编辑表观基因组的手术刀，而不必担心脱靶效应，这在不久的将来就会清楚。

原位测序

新一代测序技术在RNA测序上的应用已带来RNA内容的更全面了解。然而，现有的RNA测序技术是基于纯化好的核酸，却丢失了序列的空间背景。原位测序（In situ sequencing）有望更深入地了解细胞的基因表达程序及形态与局部环境之间的关系。《Nature Methods》编辑Tal Nawy认为，尽管预测这一技术的最终形式和潜力还为时过早，但目前已开始朝这一方向努力。

原位杂交等方法一直用于定位完整细胞和组织中的序列，但其限制在于必须清楚目标序列。在测序方面，许多技术都利用基于光的读取，这表明它们可能与完整组织的成像相兼容。但扩增和测序反应需要特殊的底物，或需要在乳液中彼此分离。

去年10月，瑞典斯德哥尔摩大学的研究人员在《Nature Methods》上发表了一种新策略：滚环扩增（rolling circle amplification）。这种方法依赖一种锁式（padlock）探针，它与目标序列的任一侧杂交，以形成环状模板，进行复制。由于产物是拴在模板上的，这提供了可靠定位，并可通过连续的寡核苷酸探针掺入，实现原位测序。

这是第一次实现了在细胞或者组织中对目的RNA分子进行测序，极大地保留了RNA分子的位置信息。也就是说，得到序列的同时，我们还能够知道这些序列来自哪些细胞或者组织的哪个部位。

目前，这种技术仍处于原理验证的阶段。虽然测序长度只有4个碱基，但已经可用来检测基因组中一些存在突变的短序列。研究人员以HER2转录本阳性的人乳腺癌组织为样本，证明了转录本片段的测序可在组织切片中直接开展。

今后，有必要增加单细胞中可被拷问的转录本数量和序列长度，以及平衡图像分辨率和组织范围的成像能力。在这一放大过程中，图像配准方法是关键要素，而定量与形态关联的工具也是必要的。

这一技术的最终目标是测序多个位点，甚至是转录组或基因组中大的片段，但这仍需要解决信号密度的问题：在如此狭小的空间内，细胞包含了太多可被成像的信息。未来，我们有望看到测序与生物学背景的更紧密连接。

迷你胞内探针

追踪小的分子并干扰其活性对了解活细胞如何工作很有用。随着显微镜分辨率的提高，更多细胞进入到我们的视线。在这一背景下，选择合适的探针就更为关键。于是，《Nature Methods》将目光投向一些细胞内的迷你粘合剂（mini-binders），认为它们值得关注。

对于细胞内蛋白的探针而言，什么最关键？首先，它们应当是目标特异的。其次，不干扰蛋白的功能、定位或表达。此外，它们还应该足够小，这样才能接近角落中的蛋白。研究人员认为，遗传编码的探针是首选，因为它们能轻松导入特定细胞或靶定细胞器。

针对这些要求，研究人员开始将注意力转向胞内抗体和适体。胞内抗体（intrabody）是指在细胞内表达并作用于细胞内组分的抗体。它们可从一些天然产生极小抗体的动物（如骆驼或鲨鱼）中获得，也可经大的哺乳动物抗体改造而来。适体（aptamer）是指与特定的目标分子结合的寡聚核酸或是肽链。适体常常从大量的随机序列被挑选出来，但天然的适体依旧存在如核糖开关中。

编码这些迷你粘合剂的基因可与其他遗传编码的元件或蛋白相融合，以监控或扰乱细胞内的组分和过程。美国南加州大学的研究人员就在《Neuron》报道了这样的成果。他们将胞内抗体与神经突触蛋白相结合，实时观察活神经元的突触。这使得研究人员首次观察到兴奋性和抑制性的突触。

瑞士巴塞尔大学的研究人员也开发出一种遗传编码的方法，来快速去除真核生物遗传体系中的绿色荧光蛋白（GFP）。这种基于纳米抗体的方法是通用的，因为它依赖进化上高度保守的真核功能-泛素通路。纳米抗体也被加州大学的研究人员所采用，来分析G蛋白偶联受体（GPCR）的动态构象变化。

此外，哈佛大学医学院的研究人员还以GFP为支架，将不同的分子组件组合在一起，驱动基因表达。他们以结合GFP的纳米抗体为基础，构建出一系列嵌合蛋白或融合蛋白结构域。当两种这样的融合蛋白被导入到细胞时，GFP将它们结合在一起，从而触发这些融合蛋白的相互依赖的活性。

《Nature Methods》编辑Erika Pastrana认为，这些探针的进一步优化将使其应用更方便、更广泛。鉴于它们的独特性质，这些迷你粘合剂无疑是生物学实验中大有前途的工具。

低温电子显微镜

低温电子显微镜（cryo-EM）虽然是结构生物学研究中的重要工具，但其潜力还未充分发挥出来。近期的技术进步大大提高了cryo-EM的分辨率，正在重振这一领域。

在单粒子cryo-EM实验中，大分子集合体被冷冻在一层薄薄的冰中，并用电子显微镜成像。单个集合体的数千至数百万幅图像必须经过计算机比对和合并，以获得一个三维结构。

与X射线晶体衍射相比，cryo-EM的一个明显优势就是不需要结晶，这大大拓宽了其研究领域，使生物大分子及其复合物的构象研究成为可能。运用这种方法，一些生物样品如病毒和大肠杆菌70S核糖体的三维重构图已经得到，但分辨率不是很高。

尽管人们早已认识到，cryo-EM有潜力达到原子级别的分辨率，但目前仍存在一些技术限制。它们包括难以产生足够量的样品，结构异质性，辐射损伤，电子束诱导的样品移动以及相机效率低。

不久之前，cryo-EM的用户只有两种选择来捕获电子显微镜的图像：低效的数字CCD照相机或不方便的照相胶卷。而直接检测电子的新型照相机实现了更快速、更高效的图像采集，解决了上述的一些限制。这些照相机记录了样品暴露于电子束过程中的一段视频，可通过帧同步进行校正。

2013年发表的两篇文章使用了这一策略。美国加州大学旧金山分校的研究人员利用一种新开发的单电子计数探测器，证实了电子束诱导的移动会大幅降低分辨率，并且，他们发现，快速读取与几乎无噪音的电子计数的组合使图像模糊得以校正，将图像信息恢复到高分辨率。这种方法大大提高了cryo-EM的图像质量和数据采集效率，实现了接近原子的分辨率。

英国医学研究委员会的研究人员也评估了新一代的直接电子探测器在cryo-EM结构测定上的潜力。利用一种新开发的statistical movie processing方法来补偿电子束诱导的移动，他们发现核糖体结构可达到接近原子的分辨率，而粒子比之前少了两个数量级。

结合快速改进的样品制备方法、繁重任务的自动化以及数据分析的新算法，单粒子低温电子显微镜有望为大分子集合体带来新的见解，而这正是结构鉴定上极具挑战性的一面。