干货分享 | 实验室常用蛋白检测方法

good

实验室超常用的蛋白浓度测定方法，看这一篇就够了！选对方法，实验效率倍增！
Part1 紫外吸收法(A280法)


蛋白质中的色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）残基在280nm附近有紫外吸收峰。通过测量蛋白质溶液在 280 nm 处的吸光度值，可以估算蛋白质浓度。基于Beer-Lambert定律：A=εbc，其中A是吸光度，ε是摩尔消光系数，b是光程，c是浓度。对于蛋白质，ε和b在特定条件下可以视为常数，因此吸光度A与浓度c成正比。通常假设蛋白质的平均消光系数ε约为1.0(mg/mL)^-1 cm^-1。
The merits of this method 优点
快速简便
操作非常简单快捷，只需使用紫外分光光度计直接读取280nm处的吸光度即可。
非破坏性
样品可以回收，因为测量过程中样品没有被化学修饰或消耗。
不需要试剂
除了缓冲液，不需要额外的化学试剂。
适用于高浓度蛋白质
在高浓度范围内也相对准确。
The demerits of this method  缺点
干扰多
核酸(DNA,RNA)在 260 nm 处也有很强的紫外吸收，在 280nm 处也有一定吸收，会干扰蛋白质的测定。其他一些小分子物质也可能在 280 nm 处有吸收，造成结果偏差。
灵敏度较低
对于低浓度的蛋白质溶液，吸光度值可能太低，误差较大。
准确性受蛋白质组成影响
不同蛋白质的色氨酸和酪氨酸含量差异很大，导致其摩尔消光系数差异也很大。使用平均消光系数进行估算，准确性会受到蛋白质自身氨基酸组成的影响。如果蛋白质样品中Trp 和 Tyr 含量异常高或异常低，误差会更大。
需要纯净样品
样品中不能含有大量干扰紫外吸收的物质，如核酸、某些染料等。
Part2 考马斯亮蓝法（Bradford法）


考马斯亮蓝G-250染料在酸性条件下与蛋自质结合，染料从红色形式（最大吸收波长在465 nm）转变为蓝色形式（最大吸收波长在595 nm）。这种颜色的转变是由染料与蛋白质结合后，染料分子结构发生变化引起的。结合主要是通过静电相互作用和范德华力，特别是染料的磺酸基团与蛋白质的碱性氨基酸残基（如精氨酸、赖氨酸和组氨酸）以及芳香氨基酸残基的非极性区域相互作用。颜色的深浅（在595 nm 处的吸光度）与蛋白质浓度成正比。
merits of this method 优点
灵敏度较高
比紫外吸收法灵敏度高，适用于测定较低浓度的蛋白质。
操作简便快捷
试剂单一，操作步骤少，反应迅速，通常几分钟内即可完成。
受样品中盐和缓冲液干扰小
相对于其他比色法，受样品中常见的盐、缓冲液等干扰较小。
稳定性好
染色后的蓝色复合物在室温下可以稳定一段时间，方便读取数据。
demerits of this method  缺点
标准曲线依赖性
需要使用已知浓度的标准蛋白质(通常是牛血清白蛋自BSA)制作标准曲线，才能定量。不同蛋白质与染料的结合能力有所差异，因此使用 BSA标准曲线测定其他蛋白质，结果可能存在偏差。
蛋白质种类依赖性
不同蛋白质与染料的结合能力不同，导致对不同蛋白质的定量结果准确性不同。碱性氨基酸和芳香氨基酸含量高的蛋白质测定结果相对准确，反之则可能偏差较大。
试剂会染色比色皿
考马斯亮蓝染料容易染色玻璃或塑料比色皿，需要小心操作，或者使用一次性比色皿。
线性范围有限
在较高蛋白浓度下，反应可能出现饱和，导致标准曲线非线性。
对去垢剂敏感
一些去垢剂，如SDS，会干扰Bradford反应。
Part3 Lowry法


Lowry法是一种经典的蛋白质定量方法，基于两个连续的化学反应。第一步是蛋白质中的肽键与铜离子在碱性条件下反应，形成复合物，铜离子被还原为亚铜离子。第二步是还原的亚铜离子还原FolinCiocalteu试剂(磷钼酸和磷钨酸的混合物)，使试剂显色，产生蓝色。颜色的深浅(通常在750nm或660nm处测量吸光度)与蛋白质浓度成正比。
merits of this method 优点
灵敏度较高
比紫外吸收法和 Bradford 法更灵敏，可以检测更低浓度的蛋白质。
受蛋白质组成影响相对较小
因为是基于肽键反应，受不同蛋白质氨基酸组成的影响比 Bradford 法小一些。
demerits of this method  缺点
操作步骤繁琐
需要多个试剂，操作步骤较多，耗时较长。
试剂不稳定
Folin-Ciocalteu 试剂不稳定，容易受还原性物质污染，需要临用前配制。
干扰多
容易受到多种化学物质的干扰，包括一些缓冲液成分（如Tris，EDTA），以及非离子型去垢剂、还原剂等。需要严格控制样品和试剂的纯度。
时间依赖性
显色反应需要精确控制反应时间和温度，反应时间过长或过短都会影响结果的准确性。
标准曲线依赖性
同样需要使用标准蛋白质制作标准曲线。
Part4 BCA法


BCA法原理与Lowry法类似，也是基于两个步骤的反应。第一步是蛋白质中的肽键将铜离子 在碱性条件下还原为亚铜离子 。第二步是亚铜离子与 BCA试剂(二喹啉甲酸)反应，形成紫色的 BCA-Cu*复合物，该复合物在 562nm 处有最大吸收。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。
merits of this method 优点
灵敏度高
与 Lowry 法灵敏度相当，比 Bradford 法和紫外吸收法高。
操作相对简便
试剂相对稳定，通常试剂以预混形式提供，操作步骤比Lowry 法简化。
受去垢剂干扰小
相对于 Lowry 法，受一些去垢剂(如 SDS,Triton X-100)的干扰较小，更适用于含有去垢剂的样品。
线性范围较宽
BCA法的线性范围比 Bradford 法宽。
稳定性好
显色后的复合物比 Bradford 法更稳定，可以放置较长时间再读取数据。


demerits of this method  缺点
标准曲线依赖性
需要使用标准蛋白质制作标准曲线。
铜离子还原反应
基于铜离子还原反应，容易受到还原性物质的干扰。
时间和温度依赖性
反应需要加热孵育，结果受时间和温度影响。
对脂类物质敏感
脂类物质会干扰 BCA反应。
Part5 双缩脲法


双缩脲法是最早用于蛋白质定量的方法之一。在强碱性条件下，含有两个或两个以上肽键的化合物(包括蛋白质)可以与铜离子反应，形成紫红色的络合物。这种络合物的最大吸收波长在540nm左右。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。
merits of this method 优点
受蛋白质组成影响最小
因为是直接与肽键反应，受不同蛋白质氨基酸组成差异的影响最小，对不同蛋白质的定量相对比较准确。
干扰少
受样品中常见的盐、缓冲液、以及一些小分子物质的干扰较小。
demerits of this method  缺点
灵敏度低
相对于 Bradford法、Lowry法和BCA法，灵敏度最低，通常只能用于测定较高浓度的蛋白质(>1mg/mL)。
需要大量样品
由于灵敏度低，需要较高浓度的蛋白质样品和较大量样品才能获得可读的吸光度值。
操作步骤较多
需要配置试剂，操作步骤相对繁琐。
标准曲线依赖性
需要使用标准蛋白质制作标准曲线。
Part6 相关耗材推荐


在实验室蛋白检测的各个环节，实验耗材的品质对检测结果的可靠性有着重要影响。爱津生物扎根生命科学领域，凭借多年积累的技术与持续创新，拥有一系列适配蛋白检测的耗材，包含普通吸头（低吸附款）、酶标板、微量离心管、常规离心管、细胞培养皿、培养板、培养瓶等。


Company Profile
关 于 爱 津
爱津生物，成立于2009年
致力于研发生产尖端生物科研领域所需的优质产品
专注生命科学、生物工程技术和实验室耗材
坚持不断优化、品质至上的原则，将更值得信赖的产品交付于您
……
选择爱津，选择品质


原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/1900168076638532025