[笔记] 实验方法论：Western Blot 原理简述

HaHa

Western blot 亦称蛋白质免疫印迹，是一种常用于研究中分离和鉴定蛋白质的技术。
它利用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 来分离指定样品中包含的各种蛋白质，然后将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或 PVDF 膜上，接下来将膜与对感目标蛋白质的特异抗体一起孵育。在洗膜过程中，未结合的抗体被洗掉，只留下与目标蛋白质结合的抗体，最后通过显影胶片或荧光扫描来检测结合的抗体。
由于抗体仅与目标蛋白质结合，因此一般只能看到一条清晰的带，条带的粗细对应于蛋白质量。通过分析特定反应的位置和强度，可以获得目标蛋白在给定细胞或组织匀浆中的表达信息。由于凝胶电泳的高分辨率和免疫的强特异性和高灵敏度，Western印迹分析可检测低至1ng的靶蛋白。
<hr/>步骤一：SDS-PAGE电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸钠-聚乙烯酰胺凝胶电泳）。SDS(十二烷基硫酸钠)带有一定的负电，起到消除蛋白结构和电荷差异的作用。在电泳过程中，分子量小的蛋白位于凝胶底部，而分子量较大的蛋白位于凝胶上部。另，关于SDS作用于蛋白的原理可见：
步骤二：Protain transfer，膜转移。通过电场的作用，使得蛋白从凝胶内部转移到膜表面，便于与抗体作用。常用膜有硝酸纤维素膜和PVDF(聚偏氟乙烯)膜。值得注意的是，在安插“三明治”过程中，凝胶应对向负极（黑板），膜对向正极。在膜转移槽中，加入甲醇作缓冲液，可以使蛋白与SDS分离而更易与膜结合。“三明治”中滤纸的使用是为了便于甲醇的流动。
步骤三：Blocking，膜封闭。防止抗体的非特异性结合。膜具有与蛋白高度亲和的能力，应封闭剩余空着的结合位点，防止后续抗体与膜直接结合干扰实验结果。常使用脱脂牛奶或BSA(牛血清蛋白)作为缓冲液。
步骤三：Antibody proting，抗体孵育。一抗首先与检测蛋白结合，并准备与二抗结合，一个一抗可与多个二抗结合。一抗的特异性强而标记成本高。结合后TBS/T洗去游离一抗。随后进行二抗孵育。二抗结合一抗后起到放大检测信号的作用。孵化完成后同样进行洗膜，洗去游离二抗。二抗上携带HRP(Horseradish Peroxidase，辣根过氧化物酶)，遇到对应底物的时候可产生化学发光，使得条带成像。
步骤四：Detection，成像。
<hr/>感谢学姐简明易懂的讲解，感谢伟大的互联网精神。
Western Blot具体操作可见
另附上可能有用的链接。


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