干货分享 | 你不可不知的数字PCR技术

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今天，我们聊一聊dPCR技术，首先，我们先了解下什么是dPCR？
dPCR：数字PCR（Digital PCR，dPCR），通过将待测样本进行极限稀释，使每个反应室中平均只有一个拷贝或者没有目标DNA分子，然后加入荧光信号进行PCR扩增，可以检测到低至一个拷贝的突变。



dPCR检测原理：数字PCR是一种核酸检测和绝对定量的新方法。同传统PCR以及qPCR相比，数字PCR增加了一步分液(partitioning)的操作，将几十微升的已经配好的包含有引物、模板、buffer、酶等组分的PCR反应体系分隔成了众多微小的、独立的反应体系，这样能够直接数出DNA分子的个数，对起始样品绝对定量，通过将一个样本分成几万到几百万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子( DNA 模板) ，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，有荧光信号记为1，无荧光信号记为0（不同于qPCR 对每个循环进行实时荧光测定的方法，数字 PCR 技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集）。

在分配的过程中，引物、酶等组分过量，而模板则是不过量的。模板DNA分子随机地进入到各个小的反应体系中，经过PCR扩增后，包含模板的体系完成扩增，不包含模板的体系无扩增（ddPCR的原理与荧光PCR的反应原理和是一样的，可以设计TaqMan探针、分子信标探针或者采用染料法进行检测，伯乐公司推荐使用BHQ1作为粹灭基因）。

模板DNA分子进入各个小的反应体系的过程满足泊松分布规律，因此，检测扩增PCR产物的信号强度，带入泊松分布公式计算，即可计算出起始模板DNA分子的拷贝数。（目前数字PCR有两种分配技术原理，见下图1和2）



图1 芯片式数字PCR原理



图2 油包水液滴式数字PCR原理



超强的泊松统计：由于dPCR是一种终端分析法，如果目标分子没有很好的离散化，如一些小室在结束时具有不止一个的靶标（比如说在一个液滴中同时出现了几种突变的靶标，列如KRAS、EGFR、BRAF和TP53等），那么理论上结果得到的浓度可能就会弃之不用。这就是泊松统计发挥作用的地方。

据Bio-Rad实验室数字生物学中心科学事务部主任GeorgeKarlin-Neumann称，泊松统计描述了一种随机分布。只要小室没有达到饱和，用户就可以反算他们起始的分子数，即使一些孔中实际上容纳了不止一个分子（这种情况在数字PCR中读做单一计数）。只要你告诉我你有多少小室或者多少液滴，（并且）它们中多大比例呈阴性。它就会基本上告诉我初始的浓度，这也将告诉我阳性小室与阴性小室的比例。

分子混合物被离散或分隔化到大量的反应室中（越多越好），这样每个室中平均有一个或零个目标核苷酸。对每个区划进行PCR反应后，使用泊松统计将阳性信号的计数转换为一个绝对值。

如果将这一过程比作一代测序（Sanger测序），在单个管中对100个模板分子的混合物（其中有一个是突变的）进行测序会产生一个电泳图谱，其中在突变位点上的显著信号会是野生型碱基。

你甚至基本不会发现，在（信号峰）下存在着一个表示不同碱基读取的小突起，因为它在整个分子混合物中的占比太低了。但将这些分子稀释并将其分布在多重反应中，就能产生出99个野生型信号和一个明显的突变信号，这就是数字的、绝对定量的结果，也是dPCR最大的优势之处。



dPCR与qPCR比较

数字PCR与传统PCR技术不同，数字PCR采用绝对定量的方式，采用的策略简单概括就是“分而治之”，类似于计算机科学中的“分治算法”，将一个标准PCR反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子( DNA模板) ，实现“单分子模板PCR扩增”，扩增结束后，通过阳性反应器的数目“数出”目标序列的拷贝数，特别适合在复杂背景中检测稀有突变。





数字PCR“分而治之”

国家食品药品监督管理总局对数字PCR的工作原理描述：对目标核酸序列定量和定性检测，用聚合酶链式反应分析法，将具有荧光定量PCR的反应物(TaqMan探针法或SYBR绿色引物法)加载到芯片上，然后用dPCR扩增仪进行热循环反应。芯片反应完成后放到dPCR分析仪上进行成像和分析，输出原始数据，将原始数据放到云端的dPCR软件上分析，并得到最终结果。仪器每处理一个芯片，只要一分钟仪器就能读完芯片。
整个实验主要操作步骤





dPCR检测技术点评

优点：
1，灵敏度高，可检测低至0.1%的突变；
2，能够进行绝对定量，不依赖对照品或标准品；
3，操作过程简单；
4，结果分析简单。

缺点：
1，通量较低（一管最高10重反应）
2，需要特殊仪器设备；
3，适用范围较为单一；
4，检测成本较高。

此方法适宜于对ctDNA或者其他低浓度样本的低频突变进行检测，特别适用于“液体活检”。

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