PCR实验“翻车”？这些“隐形杀手”你得知道！🧬🔍

青草

做PCR实验，是不是经常遇到结果不如预期的情况？  别急，今天就来给大家揭秘，PCR实验中的“隐形杀手”——PCR抑制物，它们到底是怎么偷偷摸摸影响DNA检测的，赶紧搬好小板凳，认真听讲啦！


  PCR抑制物是什么？
PCR抑制物就是那些会干扰PCR反应顺利进行的“捣乱分子”。它们可能来自样本本身，也可能是在实验过程中不小心混进来的。这些抑制物会通过各种“花招”影响DNA模板的识别和延伸，让你的PCR实验“翻车”。
  PCR抑制物的“花招”

1️⃣ 物理阻碍
有些大分子物质，比如蛋白质和多糖，会和DNA模板“抱成一团”，形成复合物。这样一来，聚合酶就没办法和模板结合，DNA链的延伸就被堵住了。
2️⃣ 化学修饰
抑制物可能会和DNA模板来一场“化学反应”，比如甲基化、氧化等，改变模板的化学结构。聚合酶通常只能识别特定的DNA结构，一旦结构变了，它就认不出来了。
3️⃣ 空间位阻
有些抑制物会专门“霸占”DNA模板上的特定区域，让聚合酶没办法靠近或者沿着模板移动，DNA链的延伸就被卡住了。
4️⃣ 电荷干扰
带电的抑制物可能会和DNA模板的磷酸骨架“打成一片”，影响聚合酶和模板的结合。比如，多价阳离子（如Mg²⁺）在PCR中是必需的，但如果其他金属离子（如铜、锌等）过量存在，它们就会和Mg²⁺“抢地盘”，干扰聚合酶的活性。
5️⃣ 模板二级结构变化
某些抑制物可能会让DNA模板的二级结构发生变化，比如促进发夹结构的形成或者稳定G-四联体等。这些结构的变化会阻碍引物的退火和聚合酶的延伸。
6️⃣ 影响引物与模板的结合
抑制物可能会和引物“纠缠不清”，阻止引物和模板正确配对，或者改变引物的结构，让引物没办法有效退火。
7️⃣ 直接抑制聚合酶活性
有些抑制物可能会直接和聚合酶的活性中心“亲密接触”，改变聚合酶的空间结构或者电荷分布，让聚合酶的活性降低。
8️⃣ 影响dNTPs的可用性
抑制物可能会和dNTPs“拉帮结派”，形成稳定的络合物，导致dNTPs没办法被聚合酶利用。
  怎么“制服”这些“隐形杀手”？

1️⃣ 优化PCR条件

• 样品预处理：对样本进行适当的预处理，比如离心、过滤等，去除可能存在的抑制物。
  
• 调整PCR混合物成分：增加聚合酶的量，或者使用具有抗抑制特性的聚合酶。
  
• 使用添加剂：加入能够减轻或消除抑制影响的添加剂，比如BSA、T4基因32蛋白等。
  

2️⃣ 注意实验操作

• 避免污染：在实验过程中，严格遵守无菌操作规范，避免样本和试剂被污染。
  
• 控制反应条件：根据实验需求，合理设置反应温度、时间和循环数，确保PCR反应顺利进行。
  

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