18S 荧光原位杂交（FISH）实验总算是做出来了！

奋斗的小鸟

之前一直想在Hela细胞里面用荧光原位杂交技术检测一下18S 的定位，也不知道是不是合成的RNA探针检测灵敏度不够，一直做的不太理想。近期换了个探针合成试剂盒-BIOG品牌的，加上实验室师兄的悉心指导，总算是做出来了！跟大家分享一下我的实验方法和试剂:
探针合成试剂盒：BIOG Cy3标记RNA探针合成试剂盒
使用感受：合成效率和产量与同类试剂盒比的话要跟高，从检测结果看探针的灵敏度也很高
实验步骤：
一、样本处理
1、细胞培养：细胞培养至盖玻片上(使用多聚赖氨酸进行预处理)，待细胞密度达到70-90%时，用PBS洗涤细胞2次，每次3分钟。
2、固定：加入4%多聚甲醛固定液室温固定10 min。
3、洗涤：去除固定液，用PBS（DNase/RNase free）室温摇床缓慢摇动洗涤2次，每次3 min。
二、通透
4、加入0.1% Triton X-100/PBS室温处理10min。
5、洗涤：弃去通透液，用PBS摇床洗涤2次，每次5分钟。
三、样本变性
6、以上期间，配制杂交反应液，将探针加入杂交缓冲液至最终浓度为1ng/μL 。
7、滴加30μL杂交液覆盖全部样本，盖膜后，放入湿盒，85℃避光孵育5分钟，立刻冰浴5分钟。
8、将湿盒放于55℃孵育过夜（12-20小时），注意避光。
四、杂交
五、洗脱
9、避光，将样本用55℃预热的50%甲酰胺/2×SSC洗1次，5 min。
10、避光，将样本在55℃预热的0.1% Tween 20/2×SSC洗涤1次，5min。
11、避光，将样本在55℃预热的1×SSC洗涤1次，5min。
六、细胞核染色
12、 滴加 200 µL DAPI工作液覆盖样本，避光染色5 min。
13、 用1× PBS洗2次，每次2 min，之后可以直接在荧光显微镜下拍照；也可以去除PBS，滴加10-30µL抗荧光淬灭封片液封片延长保存时间，显微镜下观察拍照。
实验结果：



图A. 使用BIOG cy3标记RNA探针合成试剂盒合成Cy3标记的18S RNA探针，采用荧光原位杂交（FISH）实验检测Hela细胞中18S rRNA的定位。

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