qPCR实验概述

虎威将军

写在前面：
在说到QPCR实验之前，避免不了会提到常规PCR，如果只需要了解QPCR的小伙伴们，直接往下翻就可以看到了。
最近在用绝对定量摸索基因组DNA中目的基因的拷贝数检测，所以就又把QPCR相关的知识翻新了一下。
<hr/>聚合酶链式反应（PCR）：从模板DNA的复杂混合物中扩增特定DNA片段的实验过程。
PCR反应需要五种关键试剂：
PCR模板：也称为模板DNA，需要常规的试剂盒进行提取。如基因组DNA（gDNA），cDNA和质粒DNA。
DNA聚合酶：所有PCR反应都需要可在高温下工作的DNA聚合酶。Taq聚合酶是一种常用的酶，它可以在70°C时以60个碱基/秒的速率整合核苷酸，并可以扩增高达5kb的模板，使其适用于无特殊要求的标准PCR。
引物：DNA聚合酶需要短序列的核苷酸，以指示它们需要在哪里开始扩增。在PCR中，这些序列称为引物，是单链DNA的短片段（约15-30个碱基）。
脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）：是合成DNA新链的基础，包括四个基本DNA核苷酸（dATP，dCTP，dGTP和dTTP）。
PCR缓冲液：PCR缓冲液可确保在整个PCR反应过程中保持最佳条件。PCR缓冲液的主要成分包括氯化镁（MGCl2，充当DNA聚合酶的辅助因子），tris-HCl和氯化钾（在反应过程中保持稳定的pH值）。目前市面上已经有很多成熟的包含PCR缓冲液的Taq聚合酶。
<hr/>合成引物时需注意（也可看之前发过的引物设计的视频）：
在设计PCR引物时，首先确定要扩增的DNA区域，并设计一对专门位于目标区域的引物，一个在正向链上，另一个在反向链上。
引物须具有特异性，避免扩增出非特异性片段。
正向引物与反向引物应具有相似的退火温度，GC含量与退火温度相关，调整引物长度可以改变退火温度。
避免引物序列有二级结构或引物二聚体，会降低PCR效率。许多免费的在线工具可用于辅助引物设计。
PCR扩增包括三组被设定好的时间和温度，步骤为：变性，退火和延伸
1、变性：PCR的第一步称为变性，将模板DNA加热到95°C几秒钟，将两条DNA链分开，使它们之间的氢键迅速断裂。
2、退火：反应混合物冷却30秒至1分钟。退火温度通常为50-65°C，但确切的最佳温度取决于引物的长度和顺序。不同的引物可能具有不同的退火温度。
3、延伸：温度升至混合物中存在的DNA聚合酶的理想工作温度，通常约为72°C。DNA聚合酶附着在每个引物的一端，并合成与模板DNA互补的DNA新链。
<hr/>常规PCR:一般用于扩增DNA样品中实验需要的目的DNA。
主要步骤：从细胞/血液/组织中提取DNA，检测DNA纯度-----加PCR反应体系（一般为25μL/50μL）-------PCR仪器设置程序跑PCR-------琼脂糖凝胶电泳-------照胶仪器照胶，检测你需要的DNA片段是否被扩出来-----琼脂糖凝胶目的条带切胶------生工测序
体系（25 μL）：
Taq酶      12.5 μL
DNA样品      100 ng
F-Primer/R-Primer     各1 μL
ddH2O         9.5 μL
<hr/>实时荧光定量PCR（QPCR）：一般用于检测样品中目的基因的表达量。比如：在实验过程中，构建了目的基因的过表达载体，转染进细胞后，实验中需要在转录水平和蛋白水平检测目的基因的表达，转录水平就需要用到QPCR，蛋白水平就是WB。也可用于检测基因组DNA中目的基因的拷贝数。
主要步骤：从细胞/血液/组织中提取RNA，检测RNA纯度-------去除基因组DNA-------逆转录成cDNA------配置QPCR预混液--------QPCR96孔板排版加样，3个复孔------上机QPCR仪器检测-------根据CT值分析实验结果。
根据荧光类型主要分为荧光嵌合法（又称为染料法）和荧光探针法
荧光嵌合法



图片来源于网络，侵删

体系（20 µL，Takara）：
TBgreen                 10 µL
ROX Dye Ⅱ            0.4 µL
cDNA                       1 µg
Primer F                   0.6 µL
Primer R                   0.6 µL
ddH2O                      7.4 µL
荧光探针法



图片来源于网络，侵删

体系（20 µL）：
Premix ExTaq                        10 µL
目的基因探针引物                  0.6 µL
样品DNA                                 5µL
目的基因Primer F                   0.6 µL
目的基因Primer R                   0.6 µL
ddH2O                                     3.2 µL
注意：探针法特异性更高，但价格较贵；因此实验室大多选择染料法。
<hr/>绝对定量：需要引入标曲，用已知浓度的标准品绘制标准曲线推算未知样品的量。
将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线；
对未知样品进行定量时，Log(起始浓度)与循环数呈线性关系，根据未知样品的CT值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。
暂时先写到这里了，周末会更新相对定量QPCR的相关实验操作，有需要的可以蹲一蹲啦~
作者：西分测小师妹 生物：QPCR实验概述 出处：bilibili

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