实验干货 | 流式细胞术基本原理，看这一篇文章就够了

营养师

一、基本概念
1. 流式细胞仪(Flow Cytometer):是现代物理电子技术、激光技术、计算机技术于一体的先进科学技术设备。
2. 流式细胞术(Flow  Cytometry):利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。
二、流式细胞仪的基本功能与应用
定性或定量分析功能
细胞膜：细胞表面抗原，表面糖类，表面受体，膜电位，膜结合钙离子，细胞表面电荷等，这对确定细胞的性质及其功能重要；
细胞质：各种细胞成分，包括蛋白质、RNA、各种细胞器中的特殊成分、各种抗原、基因编码蛋白、细胞因子等；
细胞核：DNA、RNA、蛋白质等 。
分选功能：可将具有特定性状或功能的细胞从混合细胞群中分离出来，再进行分析或培养。优点：分选纯度高（可达99%），分选回收率高，可分选活细胞。
流式细胞仪的结构：激光光源及光束形成系统，流动室及液流驱动系统，光学系统：透镜、滤光片、小孔、聚焦光源，收集不同波长的荧光信号。
信号检测与分析：光电倍增管（PMT ）、补偿电路。荧光信号转换为电信号，并将信号放大。存储、显示、分析系统。


三、流式细胞术基本原理
1.前向散射与侧向散射
前向散射光 (forward scatter)：FSC信号的强弱与细胞的大小相关；
侧向散射光（side scatter)：SSC信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关。


利用前向角和侧向角散射光可以把外周血白细胞分成三群，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。


2.Coulter效应与电子体积
Coulter效应原理：微小粒子并不导电，但通过充满电解液的小孔时可产生电阻变化，细胞体积越大，电阻的改变越大。可将电阻变化记录为电位变化，用于微小粒子体积测量和计数上。采用这种方法计算该颗粒的体积就是电子体积。


3.荧光信号及其面积与宽度
荧光信号被光电倍增管收集，形成信号脉冲，每个信号脉冲都有其高度、面积与宽度。每种颜色的荧光占用一个特定的检测器，每种颜色的检测器称为一个荧光通道。脉冲高度表示荧光信号的强度，表示为FLn-Height，n为仪器的荧光收集器序数。脉冲面积（FLn-A）是采用积分计算的荧光通量。（荧光脉冲面积比高度更能准确反映DNA含量，用于DNA倍体分析）脉冲宽度（FLn-W）反映荧光的分布，常用来区分双连体细胞。




4.光谱重叠与荧光补偿
利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿”。




以FITC、PE双色分析为例：
（1）先调节阴性对照管（即同型对照IgGFITC、IgGPE）：先将原补偿清零，通过调节电压，使阴性群落在FITC和PE双阴性区。阴性对照的作用是，调节各荧光探测器合适的放大倍数，即归零。


（2）FITC标记抗体/IgGPE：(IgGPE为同型对照) 此时电压已通过阴性对照设定，绝不能变动。当PE探测器检测到的FITC信号恰好完全消除时，补偿便是正确的，即FITC单阳性细胞的PE信号与阴性对照的PE信号一致。注：首先要知道双阴性细胞的情况，其次是在检测管中，必须要有FITC单阳性细胞和双阴性细胞。


（3）IgGFITC/PE标记抗体：同理，将进入FITC探测器的PE信号降至本底一致，前提是必须有PE单阳性细胞和双阴性细胞。
（4）当设置好以上补偿条件后，即补偿调节完毕。


（5）进行多色分析时，必须做各荧光间的补偿。方法同上，先准备各种标记的荧光阴性对照，确定合适的电压，并逐一调节各荧光标记抗体，与其他荧光对照，然后调节特异性荧光对每个荧光的补偿。


5.细胞基础荧光域值与阴性对照置信区间
对于流式样本，由于细胞的自发荧光、荧光抗体会与待测标本中的细胞发生少量非特异性结合，在流式细胞仪上可检出一定的信号，这部分信号称为基础荧光域值。在流式标本检测过程中，通常需要通过调节电压将阴性细胞的基础荧光域值置于95%或99%的置信区间内，作为阴性对照可信区间设定。


四、流式细胞术结果与数据分析
1.单参数直方图
以分布直方图( distribution  histogram )来显示，横轴为该参数测量强度相对值。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数。


看图技巧：
①先看横、纵坐标，了解检测目的；
②看图形分布，直方图峰形越往右移，代表其荧光强度越强；
③M1的确定是根据阴性对照细胞的基础荧光域值设定的，峰形右移，荧光信号大于基础荧光域值（M1），表示阳性（M2）；
④数据统计时，检测目的物一般用各Marker区内的细胞所占百分比或用平均荧光强度表示；
⑤几个直方图的比较，关键看Marker（M1、M2）的位置以及细胞数。
2.二维散点图
     能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系，横、纵坐标分别代表两个独立参数，平面上每一个点表示具有相应坐标值的细胞。




3.二维等高线图


4.假三维图纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数。


5.三维图
任意选三个参数为x，y，z轴，构成一个三维图，每一群细胞根据各自参数处于一个相对独立的空间，三维图对比较复杂的亚群的显示更为直观明了。


6.设门
流式细胞术数据分析的目的是通过与适当的阴性对照进行比较，来确定所分析样本中表达标记物的细胞百分率。完成这一过程的第一步就是需要确定我们所要研究的目的细胞群，其术语为设门（gating）。
设门是指在细胞分布图中指定某一个范围或某一细胞性状的细胞群，并对其进行单参数或多参数分析，根据某一细胞性状设门进行组合。
五、流式细胞术的技术要求
1.样本制备
①流式细胞仪的样品要求：
    a.单细胞悬液，避免任何细胞沉积
    b.被检细胞或颗粒大小0.2－40um
    c.样品中至少20000个细胞，浓度105—106个/毫升
②培养细胞的样品制备
    单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。
    悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备成单细胞悬液。
③新鲜实体组织单细胞悬液的制备
     机械法：剪碎法、网搓法、研磨法；
     酶处理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等；
     化学试剂处理法：EDTA、EGTA等；
     表面活性剂处理法：Triton-100、皂素等。
     机械法往往造成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。如用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等，也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片的干扰。
     酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成分的不良影响。FCM所测细胞是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光染色处理不受影响。
④单细胞悬液的保存
     防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法：
     深低温保存法：深低温冰箱，保存一年；
     乙醇与甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇；
     甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但细胞表面荧光染色分析不受影响。

六、常用荧光染料及标记颜色


七、流式常见应用范围
细胞大小
细胞颗粒度
细胞表面分子：CD系列
细胞浆内分子：各种细胞因子
细胞核内分子：P53等
细胞功能检测：细胞周期、凋亡、铁死亡等

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