实验干货 | 感受态细胞制备原理与操作流程

生物科研实验室

一、原理当大肠杆菌处于对数生长期时，细胞膜表面形成短暂的通透性窗口。此时用冰冷的CaCl₂溶液处理，可诱导细胞膜磷脂层形成局部孔隙，并通过钙离子中和DNA的负电荷，促使质粒吸附于细胞表面。随后的42℃热激（90秒）使细胞膜产生热胀冷缩的物理形变，质粒DNA顺势“滑入”胞内；而冰浴骤冷则让膜结构瞬间固化，将DNA锁在细胞内。这一系列操作的核心在于精准控制细胞代谢状态、离子浓度和温度变化的时间节点。二、材料准备1.菌株选择：常用DH5α、BL21(DE3)等缺失核酸内切酶（endA1）及重组酶（recA1）的菌株，减少质粒降解风险。2.试剂配制：•CaCl₂溶液：0.1 M CaCl₂（需用超纯水配制，0.22 μm滤膜除菌，4℃预冷）；•复苏培养基：含10%甘油的LB液体培养基（灭菌后分装，-20℃保存备用）；•选择性平板：LB琼脂 + 对应抗生素（如Amp 100 μg/ml），提前倒板干燥。3.器具灭菌：50ml离心管、枪头等需121℃高压灭菌20分钟，冰盒预冷至4℃。
三、操作流程
一、原理当大肠杆菌处于对数生长期时，细胞膜表面形成短暂的通透性窗口。此时用冰冷的CaCl₂溶液处理，可诱导细胞膜磷脂层形成局部孔隙，并通过钙离子中和DNA的负电荷，促使质粒吸附于细胞表面。随后的42℃热激（90秒）使细胞膜产生热胀冷缩的物理形变，质粒DNA顺势“滑入”胞内；而冰浴骤冷则让膜结构瞬间固化，将DNA锁在细胞内。这一系列操作的核心在于精准控制细胞代谢状态、离子浓度和温度变化的时间节点。二、材料准备1.菌株选择：常用DH5α、BL21(DE3)等缺失核酸内切酶（endA1）及重组酶（recA1）的菌株，减少质粒降解风险。2.试剂配制：•CaCl₂溶液：0.1 M CaCl₂（需用超纯水配制，0.22 μm滤膜除菌，4℃预冷）；•复苏培养基：含10%甘油的LB液体培养基（灭菌后分装，-20℃保存备用）；•选择性平板：LB琼脂 + 对应抗生素（如Amp 100 μg/ml），提前倒板干燥。3.器具灭菌：50ml离心管、枪头等需121℃高压灭菌20分钟，冰盒预冷至4℃。三、操作流程
一、原理当大肠杆菌处于对数生长期时，细胞膜表面形成短暂的通透性窗口。此时用冰冷的CaCl₂溶液处理，可诱导细胞膜磷脂层形成局部孔隙，并通过钙离子中和DNA的负电荷，促使质粒吸附于细胞表面。随后的42℃热激（90秒）使细胞膜产生热胀冷缩的物理形变，质粒DNA顺势“滑入”胞内；而冰浴骤冷则让膜结构瞬间固化，将DNA锁在细胞内。这一系列操作的核心在于精准控制细胞代谢状态、离子浓度和温度变化的时间节点。二、材料准备1.菌株选择：常用DH5α、BL21(DE3)等缺失核酸内切酶（endA1）及重组酶（recA1）的菌株，减少质粒降解风险。2.试剂配制：•CaCl₂溶液：0.1 M CaCl₂（需用超纯水配制，0.22 μm滤膜除菌，4℃预冷）；•复苏培养基：含10%甘油的LB液体培养基（灭菌后分装，-20℃保存备用）；•选择性平板：LB琼脂 + 对应抗生素（如Amp 100 μg/ml），提前倒板干燥。3.器具灭菌：50ml离心管、枪头等需121℃高压灭菌20分钟，冰盒预冷至4℃。三、操作流程


四、转化低解决方案1.菌落稀少/无菌落：检查质粒浓度（NanoDrop验证）、抗生素浓度（过期需更换）、热激温度（用温度计校准金属浴）。2.卫星菌落过多：平板抗生素失效（重新配制）、涂布前未充分混匀（加入40μl X-Gal/IPTG后静置5分钟再涂布）。3.菌落大小不均：感受态细胞部分死亡（避免反复冻融，仅解冻一次使用）。4.假阳性克隆：质粒未酶切完全（电泳验证线性化程度）、感受态细胞残留内源质粒（改用endA1缺陷型菌株）。