免疫荧光和WB的一抗能不能共用，为什么

非诚勿扰孟非

1. 相同点

- 抗体特异性：两种方法都使用针对特定抗原的一抗，因此如果目标蛋白相同，理论上可以使用相同的抗体。
2. 不同点

(1) 实验条件差异

• 缓冲液体系：
  
  
  
  • 免疫荧光通常在细胞或组织样本上进行，使用的缓冲液可能含有 Triton X-100 或其他去垢剂，以保持细胞结构完整。
    
  • Western blot 则需要 SDS-PAGE 和转膜步骤，使用的缓冲液（如 TBST）含有较高浓度的盐和 Tween-20，可能会改变抗体的结合特性。
    
  
  

• 样品处理：
  
  
  
  • 免疫荧光要求样品尽量保持天然构象，以便抗体能够识别完整的抗原表位。
    
  • Western blot 中的样品经过变性处理（如加热、SDS 处理），导致蛋白质线性化，抗体可能更倾向于识别线性表位。
    
  
  

(2) 抗体类型需求

• 免疫荧光：
  
  
  
  • 常使用未标记的一抗，随后通过荧光标记的二抗检测。
    
  • 对抗体的背景信号要求较高，因为高背景会干扰荧光成像。
    
  
  

• Western blot：
  
  
  
  • 可以使用未标记的一抗，也可以直接使用 HRP 或荧光标记的一抗。
    
  • 对背景信号的要求相对较低，因为可以通过化学发光或红外成像等手段提高信噪比。
    
  
  

(3) 抗体稀释度和工作浓度

• 免疫荧光：
  
  
  
  • 抗体浓度通常较低（如 1:100~1:500），以减少非特异性结合。
    
  • 需要考虑抗体渗透性和细胞/组织中的抗原分布。
    
  
  

• Western blot：
  
  
  
  • 抗体浓度较高（如 1:1000~1:5000），因为样品经过浓缩处理，抗原丰度更高。
    
  • 需要确保抗体能够有效结合到 PVDF 或 NC 膜上的目标蛋白。
    
  
  

(4) 抗体来源和亚型

• 免疫荧光：
  
  
  
  • 更倾向于使用单克隆抗体（mAb），因为其特异性强，适合检测细胞内低丰度蛋白。
    
  • 对抗体的种属来源无特殊限制。
    
  
  

• Western blot：
  
  
  
  • 单克隆抗体和多克隆抗体（pAb）均可使用，但多克隆抗体由于识别多个表位，可能更适合检测部分降解的目标蛋白。
    
  • 需要注意抗体种属来源与二抗匹配。
    
  
  

3. 是否可以共用？

(1) 可以共用的情况

• 如果抗体说明书明确标注适用于多种实验方法（如 IF、WB、IHC 等），并且已经过验证，则可以直接共用。
  
• 某些商业抗体经过优化设计，能够在不同条件下保持活性，例如某些兔源单克隆抗体（如 Cell Signaling Technology 的产品）。
  

(2) 不建议共用的情况

• 抗体表位识别差异：
  
  
  
  • 免疫荧光中抗体可能识别天然构象的表位，而 Western blot 中抗体识别的是变性后的线性表位。如果抗体仅能识别其中一种表位，则无法共用。
    
  
  

• 实验条件不兼容：
  
  
  
  • 如果抗体对缓冲液成分敏感（如盐浓度、pH 值、去垢剂等），则可能在一种实验中表现良好而在另一种实验中失效。
    
  
  

• 背景信号问题：
  
  
  
  • 某些抗体在 Western blot 中表现良好，但在免疫荧光中可能导致高背景信号，影响结果解读。
    
  
  

4. 实验验证

• 如果不确定某抗体是否可以在两种实验中共用，可以通过以下步骤验证：
  
  
  
  • 预实验：在目标实验条件下测试抗体的结合效率和特异性。
    
  • 优化条件：根据实验结果调整抗体稀释度、孵育时间或缓冲液成分。
    
  • 参考文献：查阅相关文献或抗体说明书，了解该抗体在不同实验中的表现。
    
  
  

5. 总结

免疫荧光和 Western blot 的一抗是否可以共用取决于抗体的特异性、实验条件以及抗体本身的性质。理论上，经过验证的抗体可以在两种实验中共用，但需要注意实验条件的差异，并通过预实验确认其适用性。如果抗体说明书未明确标注适用范围，建议谨慎使用并进行充分验证。

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