单分子免疫技术与玩家

心中u你

随着阿尔茨海默症（AD）药物获批单分子免疫检测Quanterix公司股价大涨。随之而来的阿尔茨海默症相关检测、治疗、护理、心理疏导等多方面产业均有利好。其中检测领域爆出260亿元市场规模，各大厂家争相入场。
AD症的检测历来以认知测试、影像、脑脊液指标为主。主要原因是脑中Aβ聚集在血脑屏障内发生，大多数标志物无法大量穿过血脑屏障在外周血中被检测到。比如p-tau蛋白血液含量含量仅为1pg/mL左右，分型的磷酸化Tau蛋白如P-tau181、P-tau217等可能cutoff在0.5pg/mL，化学发光等传统手段无法稳定检出。这时单分子免疫检测扛起大旗。
随着7月，NIA-AA修订的阿尔茨海默病临床标准，强调血清标志物用于AD症检测。AD检测低丰度标志物将单分子免疫检测技术带入主流IVD的舞台。也是目前看来潜力最大的单分子免疫检测应用场景。
科研层面以Quanterix公司的SiMoA（single molecule array）单分子技术能否站稳IVD和生命科学，后续系列文章专题讨论。



PubMed关键词SiMoA检索文章数量超过600篇（截至20230731）


什么是单分子检测
我用自己的理解转化成大白话，一堆1元硬币里面找一个5角的硬币，简单的办法是铺平，使5角硬币暴露出来。
同样一堆分子里面找一个待检测物，把分子铺成单层，也容易找到。
常用的方法有：
多孔芯片，每个孔落一个分子。
扁片芯片，液体流过自发成单层。
薄反应杯，液体落进去成竖向单层。
也有报道利用纳米孔检测蛋白分子，液滴类的dPCR用的比较多，但还未见商品化。

单分子免疫检测技术及厂家简介【更新】
单分子免疫很多大咖官博、老纪写过技术原理，又自己学习了一遍
单分子免疫部分列表

厂家	加入时间	技术&平台
Quanterix	2007	SiMoA
Merck -Singulex	2003	SMC
宇测	2019	AST系列仪器
中科先见	2018	芯弃疾®JX-1G
光与	2019	纳米级超亮稀土上转换发光探针技术及单颗粒成像系统
彩科	2018	LyMedivh仪器、EzDec平台
富士-Fluxus	2016	PDMS装置、TRACE平台
Mecwins	2008	AVAC 技术，合作方Quidel、菲鹏
First Light Biosciences	？？	MultiPath技术，发现圣湘的执行董事zhangkeya在管理层名单，看了下是个分子诊断产品
聚光-聚拓生物	2021
瑞芯智造（深圳）	？？

1、Quanterix公司的SiMoA（single molecule array）
分子免疫阵列（single molecule array，SimoA）技术，是一种将单分子计数用于蛋白质生物标记物的检测方法。该技术检测限可达飞摩尔（fg/mL）数量级，是目前最具代表性的单分子免疫检测技术。
系统源自于DavidWalt与David Duffy的团队开发的一套“DigitalELISA”检测系统。其检测原理与数字PCR近似，都是通过微反应器单元进行单分子隔离结合单分子水平信号放大来实现的。
美国Quanterix公司的创始人是David Walt，他是美国塔夫茨大学化学系的教授，不仅是美国国家科学院和工程院的双料院士，还是基因测序龙头企业Illumina公司的创始人。
Quanterix公司诞生于2007年，由顶尖科学家Illumina创始人之一David Walt博士及其团队创立。公司成立后，自带光环的Quanterix公司陆续获得Bain Capital、生物梅里埃、ARCH Venture等顶级机构或产业公司投资。
2010年，David Walt与David Duffy于Nature Biotechnology发表SiMoA技术相关论文，首次提出Digital Elisa的技术概念。
2012年，Quanterix公司将医疗诊断业务独家授权给生物梅里埃，联合开发诊断产品。
2013年，在经历了5年艰难的研发周期后，Quanterix公司正式推出其全自动单分子免疫检测平台——HD-1系统。
2014年5月，传奇经理人Kevin Hrusovsky辞去PerkinElmer高级副总裁兼生命科学与技术部门总裁的职务加入Quanterix公司成为公司董事会执行主席，并于2015年成为公司总经理。Kevin Hrusovsky加入Quanterix后为公司梳理了更为合适的发展规划，制定了后来的上市计划及Quanterix在神经科学领域的重要战略布局。
2017年，Quanterix在纳斯达克上市，概念销售收入达到2287万美元。
2018年，公司实现销售收入3763万美元，实现了近65%的收入增长，其中有过半收入来自于药厂。该年Quanterix公司为了确保其在医疗诊断市场的自主权利，从生物梅里埃回购了SiMoA技术在医疗诊断领域的业务权利，为其后续神经科学（特别是阿尔茨海默症相关）诊断领域的市场布局做好准备。
2019年，Quanterix推出与美国Meso Scale Discovery多指标电化学发光系统对标的SP-X系统以进一步推进其在药物研发领域的市场份额，全年预计可实现营收5500万美元。
至2019年末，Quanterix公司已实现全球近400台的设备装机量，平均每台设备的试剂消耗量预计可以超过6万美元，作为科研领域的免疫检测设备，考虑到其高昂的销售价格，已经能算是战绩显赫。



Quanterix的产品线



HD-1与HD-X性能比较
SiMoA技术是基于微阵列芯片的单分子免疫检测，是在毫米级芯片上雕刻（或浇筑）成千上万个微米级微井，每个微井体积约 40 fl 左右，随后将免疫复合物磁珠分配于微井中，再借助高分辨率荧光显微镜对荧光点进行计数，依据泊松分布理论，计算同时含珠子与荧光产物孔的数量/含珠子孔总数的比值，以此确定测试样品中的蛋白质浓度。



SimoA 原理图





SiMoA通过磁珠酶联免疫反应与微孔阵列芯片的结合，实现单分子蛋白检测。其操作流程如上图
（1）利用表面标记有捕获抗体的磁珠捕获样品中的抗原；
（2）使用biotin标记的检测抗体对被捕获的抗原进行标记；
（3）加入链霉亲和素—半乳糖苷酶复合物，与检测抗体上的biotin结合；
（4）将反应洗净后的磁珠与底物混合，加载到含有微孔阵列的检测芯片中，利用磁场使磁珠落入与其尺寸完全匹配的微孔中（3μm左右），加入油相，使得微孔之间物理隔离；
（5）含有半乳糖苷酶的微孔由于酶分子催化底物产生荧光产物；
（6）对微孔阵列进行荧光成像，通过对发出荧光信号的微孔个数对照标准曲线来实现定量检测。
SiMoA系统存在很明显的一些缺点：
（1）检测操作流程过于繁琐复杂。
（2）SiMoA系统使用的盘式微流控芯片加工精度高，生产成本高昂。
（3）SiMoA检测系统单次检测耗时长达1小时以上，远超过目前免疫诊断市场中已经能轻易实现的15分钟报告时间。


Quanterix生物技术

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Quanterix官网视频
2、默克 SMC™单分子免疫检测平台
Singulex公司成立于2003年，致力于单分子水平检测技术（SMC）的开发。
公司于2006年提交SMC核心专利，并于2011年前后正式推出第一代单分子免疫检测设备Errena，以流式形式扫描通过微米级检测窗口的单分子荧光信号以实现单分子水平生物标志物的检测。因其超高灵敏度水平的检测性能，Errena系统面世后即受到生命科学领域的广泛关注。
2015年，Merck Millipore收购Singulex公司SMC技术在生命科学领域业务。
2016年1月，Singulex公司获得德国Qiagen公司5000万美元投资稀释20%股权。
2017年，Merck推出SMC新一代科研级产品SMCxPro，以解决Errena系统不稳定和假阳性问题。同年初Singulex公司推出全自动SMC检测平台Clarity并寻求合伙人以完成Clarity在FDA注册工作，并于年末公告提交Clarity设备和超敏肌钙蛋白（是的，你没看错）检测项目的510（k）申请。
遗憾的是直到2019年年中，Singulex在获得合计2.27亿美元融资后，依然没有获得FDA批准，正式于6月倒闭。



仪器及原理图





原理图
大概描述一下思路，
首先2步，抗体捕获待检测物，
3步，加入连接发光物质的抗体，形成双抗复合物，
4步，这里的洗脱应该有，但未显示，切掉发光抗体待检测物复合体，
5步，将溶液直接放置于光源下，通过光源运动在不同位置进行激发，发光值超过阈值代表一个待测复合物被激发，最后计数，通过标准曲线换算待检测物质含量。


王怀进5278

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国内单分子技术平台
宇测生物
公司成立于2019年04月02日，是实现单分子免疫诊断技术产业化的高新科技型公司，核心技术具备完全自主知识产权。公司坐落于苏州工业园区纳米城，拥有近6000平方米研发生产中心，获得国内顶级资本投资。
公司坚持“以精准检测成就人类健康，以科技创新创造无限未来”的理念，致力于新一代单分子免疫诊断技术的研发与产业化。公司产品技术有效解决了国内单分子免疫诊断市场上“卡脖子”的问题，成功填补了这一领域发展前沿的空白，并有希望推进下一代免疫诊断技术的变革。



宇测仪器平台全家福


宇测生物

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产品视频

技术上利用流通池进行单层化，并利用拍照方式进行光检测
看严总的介绍，
耗材非常少，只有反应杯。反应池可以通用复用，同级别平台成本大幅领先。
高速机型达到200t/h速度，速度够快。
对于市场和临床的认识远超其他玩家，不断解决临床问题，态度严谨专业。
之前提到AD检测不同于其他组合，中国走在了世界前列，宇测有希望能将AD血液检测赛道提升到新高度。

中科先见
成立于2018年，是中国科学院深圳技术研究院一级持股的高科技企业，依托2013年组建的广东省创新创业团队、深圳市孔雀团队的成果产业化，在“芯片+医疗”领域累计获批各级政府资助逾1亿。
·2020年获“国家高新技术企业”,并获得NMPA、CE,FDA等逾10个国内外权威认证，陆续获ISO13485/9001及20余国家/地区注册证/准入。
·2022年作为产业化主力获批建设粤港澳大湾区国创中心IVD创新平台。
·技术平台：“半导体+精准医疗”的体内外数字化传感
·核心竞争力：芯片跨界革新精准诊疗



数字化单分子检测系统 芯弃疾®JX-1G
技术上来说是落孔，但是有意思的是流体控制，看视频是芯片倾斜加液体，自发流动入孔。


，时长00:59


（来源于IVD工具人2022年6月3日直播回放）
光与生物
光与生物成立于2019年，位于粤港澳大湾区深圳市。光与生物以其核心的纳米级超亮稀土上转换发光探针技术及单颗粒成像系统，开发了极具性价比的超灵敏单分子检测技术平台，为医疗科研和诊断领域带来飞克级别（fg/ml）的检测解决方案。目前光与生物可提供定制化科研服务及系统化检测平台搭建，助您轻松点亮单分子研究的崭新视野。
突破单分子检测最为关键的荧光探针标记技术瓶颈，实现了纳米级超亮稀土上转换发光技术的成功应用，打通了对单分子进行直接观察和检测的道路，首次实现了肉眼追踪单个纳米级别探针在活体细胞内的运动。
公司创始人何皓博士于2019年10月归国创立光与生物，将该技术进行产业转换，赋能精准医疗。



DFZ-2000全自动单分子免疫分析仪（20t/h）



DFZ-1000半自动单分子免疫分析仪



“先行者”POCT单分子免疫分析仪
技术上信息尚未了解到。
彩科生物
彩科（苏州）生物科技有限公司，由多位美国海归博士于2018年在苏州生物医药产业园创立，公司以为广大生命科学研究人员提供先进研究工具，挖掘海量高分辨率生命科学数据为目标，以微尺度下多物理场耦合μ-MPF (Micro-scaled Multi Physics coupled Force)技术及高端生物芯片设计为核心，自主研发生产了高通量单细胞光导系统、单分子阵列免疫分析仪、试剂、芯片等多项高科技产品，在单分子及单细胞水平大大提升了生命科学研究人员对生命认知的分辨率。
公司自成立以来，已得到国内、外顶级生物医药投资机构如IDG、君联资本、弘晖资本、国投招商和国际著名生命科学及诊断公司珀金埃尔默（PerkinElmer）旗下产业基金PKI的青睐。公司同时也荣获了“苏州工业园区第十二届科技领军企业”、“苏州市科技计划姑苏创新创业领军人才计划立项”、“2020未来医疗100强”、“中国创新医疗器械榜单Top100”及“生命科学工具及服务”价值榜等众多荣誉。



LyMedivh™ AXL-2000





自动化单分子免疫检测仪（注册证编号：湘械注准20222221625）



单分子免疫检测设备（注册证编号：湘械注准20222220946
技术上可以看是落孔技术，参数标注了3min一个样本2-6个测试，速度也是非常快。不知道样本制备步骤是全系标配还是特定仪器。







官方公众号及文献公开资料截图
杭州聚拓
杭州聚拓生物科技有限公司（简称“聚拓生物”）创立于2021年，总部位于浙江杭州，是中国领先的分析仪器公司——聚光科技集团的成员企业，专注于生命科学实验室分析仪器的研发、生产和推广。聚拓生物拥有毛细管电泳、微流控芯片和精密光学检测等分析技术平台，致力于为临床诊断、药物研发、生物技术研究等领域的用户提供先进、稳定、灵活、可靠的分析检测产品和系列解决方案，提高实验效率、促进科技发展，为人类健康事业贡献力量。



SimFlo 1000全自动单分子荧光免疫分析仪

单分子免疫仪是具有独立自主知识产权的新一代超敏蛋白定量设备。和传统免疫检测方法的“模拟”定量方式不同，单分子免疫采用“数字化”检测的原理，其检测灵敏度超过传统免疫检测方法1000倍，被誉为是下一代的免疫分析技术。SimFlo 1000采用创新的流式荧光检测技术路线，实现了稳定可靠的超灵敏蛋白定量，且能够连续进样、符合常规操作习惯。该产品可应用于神经系统疾病、肿瘤和感染等领域的新型标志物发现和检测，也可应用于药物PK/PD分析等领域
聚光科技（杭州）股份有限公司（简称“聚光科技”）自2006年起组建高端质谱团队；2020年布局生命科学领域，成立杭州谱聚医疗科技有限公司（简称“谱聚医疗”）、杭州谱康医学科技有限公司（简称“谱康医学”）；2021年成立杭州聚拓生物科技有限公司（简称“聚拓生物”）、杭州聚致生物科技有限公司（简称“聚致生物”），全面拓展生命科学与诊断新赛道。现聚光科技生命科学板块旗下子品牌正式发布全新视觉识别系统。
瑞芯智造（深圳）
瑞芯智造（深圳）科技有限公司座落在深圳市龙华区观澜怡力科技园。拥有全球领先的创新团队和核心产品，已经获得国内外一线投资机构两轮共数千万融资。公司汇集了一批来自瑞士联邦理工、清华大学、北京大学、中科院、武汉大学、华中科技大学、中山大学等知名院校及科研机构的专业人才，拥有多项知识产权及发明专利，获得深圳市留学人员创业初期补贴等多项创新奖励资助。
      团队秉承10余年中瑞微纳加工研发沉淀，具有原子级别（1纳米以下）精度微加工能力，掌握世界先进的纳米孔技术打造的生物纳米芯片，通过捕捉纳米颗粒信息，应用于纳米颗粒（浓度、粒径、zeta电位、形态）检测以及单分子免疫（疾病相关的生物标记物）检测。产品已应用于科学研究、工业品控、生物医药、疾病诊断等多个领域。
  一直以来，瑞芯秉持用科技守护生命，用技术创造价值的理念，拥有领先的自主创新能力和完备的自主创新体系，始终致力于给客户提供全方位的颗粒表征分析方案，着力打造世界一流的纳米颗粒检测仪器生产厂商。仪器即将面世。



国内注册证情况
各厂家拿证策略上看出各家主推方向

其他玩家
Fluxus是一家总部位于硅谷的生物技术领域的创新公司，成立于2016年。富士生物集团自2017年以来一直与Fluxus合作开发基于超高灵敏度检测技术的诊断平台。预计这种新的平台技术将通过在阿尔茨海默氏症、癌症和传染病等领域进行更高的检测灵敏度诊断，创造新的临床价值。
网站是有，上面就一个x，找了相关技术拥有者Holger Schmidt的文献，多数是居于微流控芯片的技术进行检测，不排除Fluxus也是采用类似技术。看了这位科学家发的芯片名字起得很丰富（PDMS装置、TRACE平台），但不确定Fluxus用的哪个。
也发现深圳国家高性能医疗器械创新中心李皓博士来自Fluxus预计后期也会有技术转化。



Mecwins
Mecwins 由马德里微电子研究所 (IMM – CSIC) 的生物纳米力学小组负责人 Javier Tamayo 教授和 Montserrat Calleja 教授于 2008 年创立。Mecwins 的主要目标是通过超灵敏检测蛋白质生物标志物，将其技术作为医学测试的参考技术推向市场。
总部位于马德里的科技公司 Mecwins 已与 Quidel 签订许可和共同开发协议，以开发下一代即时检测仪器。
自 2019 年以来一直合作的 Quidel 和 Mecwins 打算共同开发一个平台，该平台能够检测和量化低于皮克浓度的多种样本类型的生物标志物。Mecwins 将贡献一种称为 AVAC 的灵敏、高通量技术，而 Quidel 将贡献其在试剂盒和免疫分析设计方面的专业知识。
AVAC 技术将局部等离子体共振检测与夹心免疫测定形式结合使用。



23年官网晒出与菲鹏合作参观照片



First Light Biosciences
First Light 的使命是大幅加快“获得结果的时间”，以便及早发现导致医院相关感染的传染病病原体。我们的目标是在数小时而不是数天内为临床医生提供挽救生命的抗菌药物敏感性测试结果。利用高度差异化的 MultiPath® 技术平台，我们致力于通过更快速的治疗决策来挽救患有危及生命的感染的患者的生命。
主要用来测艰难梭菌素B。看了半天，是核酸探针应该也不算免疫检测，原理上能做。





反应器底部有一层染料，减少杂光。直接通过磁微粒吸附在反应器底部，激发光激发荧光染料，荧光在放映器底部的成像芯片上留下光点，用于数字检测。



实验室性能还行
只发了文章待转化的一些技术
SiMPull（single molecule pull-down ）约翰·霍普金斯大学及类似的单分子增强捕获（single-molecule augmented capture，SMAC）



主要是利用载玻片（玻璃）表面用mPEG钝化，连接链霉亲和素和生物素化的抗体，捕获待检测物，发光可用荧光蛋白，荧光素等。



纳米孔微量检测技术平台
纳米孔测蛋白含量发表的比较新论文，简述了技术原理，是否有产业化公司，待查。



检测步骤简单介绍
a磁珠连抗体，抗体结合蛋白
b磁分离清洗，保留磁珠待检测物复合体
c加入连接了链霉亲和素的二抗孵育
d加入连接了生物素的ssDNA标签
e紫外光照断裂ssDNA，释放标签，磁分离取上清
f加入两种流星状结构核酸链（末端有11个核酸臂）P1和P2，ssDNA能与P1和P2连接形成DB哑铃状核酸链



在检测时，流星型核酸链P1和P2通过纳米孔电信号间隔大，哑铃型核酸链DB通过纳米孔信号间隔小，结合检测到的电信号变化和加入核酸链浓度可以计算得到待检测物质浓度。
液滴微量检测技术平台
文献称为ddELISA




ddELISA是一种基于微珠的数字免疫分析方法，将珠子分离到pl大小的液滴中，然后装入一个腔室，形成液滴阵列，用于分析。更具体地说，将抗体包覆的顺磁珠添加到含有目标分子的样品中。然后用生物素化检测抗体和链霉亲和素-β-半乳糖苷酶（SβG）标记目标分子，形成一个酶标记的免疫复合物。然后将珠子重悬在小体积（2ul）的底物中，荧光素二-β-D-半乳糖糖苷（FDG），混合物被分割成pL液滴，这样大多数液滴没有珠，一小部分有一个珠。然后，这些液滴被装入一个单层的腔室中，形成液滴阵列。通过三个通道的图像来识别i)液滴，ii)珠子，iii)荧光产物，从而识别“液滴上”。信号输出是用每颗珠的平均酶的单位（AEB）来测量的。（机翻）
流式单分子检测技术
学习了流式细胞大会上，孟总报告，提到流式细胞也能应用于单分子免疫检测。详见报告ppt



技术名称：Molecular On-bead Signal Amplification for Individual Counting (MOSAIC)基于磁珠信号放大的分子技术
1单个目标分子首先被过量的抗体涂层顺磁珠捕获，这样每个磁珠根据泊松分布携带0个或1个目标分子。
2用生物素化检测器抗体形成单个免疫复合物三明治，并用链霉亲和素-DNA结合物进行标记后，进行滚动环扩增（RCA），生成连接在每个免疫复合物上的长DNA连接体。
3荧光标记的DNA探针与RCA产物杂交，允许通过流式细胞仪器计数“开”和“关”的珠数
4图谱可以实现低丰度待检测物的高灵敏度定量检测。



5同样多色微球可以实现同时多种待测物检测，比现有蛋白组学的模式速度快



与Simoa进行了比较，fM级别比对还好（毕竟低端CV不一定好），LoD做出来就比Simoa高那么一点点。

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