菌种鉴定 PCR 实验手册

Rose

1. 细菌菌种鉴定

1.1 实验原理

• PCR 原理：史上最强PCR原理攻略
  
• 核酸电泳相关内容：如何跑好琼脂糖凝胶电泳？
  

1.2 实验步骤

1. 细菌基因组抽提

• 碧云天｜基因组DNA小量抽提试剂盒(通用型，离心柱式)｜产品编号：D0063
  
• 溶菌酶配置：80 mg 溶菌酶 + 3.6 mL ddH2O + 0.4 mL 高浓度缓冲液（5 mL 高浓度缓冲液配置：121.1 mg Tris + 33.6 mg EDTA-2Na 溶于 5 mL ddH2O）
  

2. 16S rRNA PCR

• 擎科生物｜TSINGKE TSE101 金牌 Mix (green)｜产品货号：TSE101
  
• 擎科生物｜27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）-1492R引物（TACGGCTACCTTGTTACGACTT）｜常规引物合
  
• 程序设定
  

25μl 体系组成：3μl Template + 1μl Forward Primer + 1μl Reverse Primer + 20μl Mix


3. 核酸电泳

• 琼脂糖凝胶（根据序列长度选择合适的胶浓度）
  
• 碧云天｜TAE (50X)｜产品编号：ST716
  
• 擎科生物｜TSINGKE TSJ003 TS-GelRed核酸凝胶染料Ver.2（10,000×水溶液）｜产品货号：TSJ003
  
• 擎科生物｜DL2000 DNA Marker｜产品货号：TSJ011
  
• 3～5μl 上样，120V 电压，电泳20min 左右
  

4. 送样双端测序
5. SnapGene 组装
6. 数据库查询

• EzBioCloud - 16S-based ID
  
• NCBI Standard Nucleotide BLAST - Choose rRNA/ITS databases
  

2. 真菌菌种鉴定

2.1 实验步骤

1. 真菌基因组抽提

• 索莱宝｜真菌基因组DNA提取试剂盒｜产品货号：D2300
  

2. ITS PCR

• 擎科生物｜TSINGKE TSE101 金牌 Mix (green)｜产品货号：TSE101
  
• 擎科生物｜ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）-ITS4引物（TCCTCCGCTTATTGATATGC）｜常规引物合成
  
• 程序设定
  

25μl 体系组成：3μl Template + 1μl Forward Primer + 1μl Reverse Primer + 20μl Mix


3. 核酸电泳
4. 送样测序
5. SnapGene 组装
6. 数据库查询

• NCBI Standard Nucleotide BLAST - Choose rRNA/ITS databases
  

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/580228390