细胞永生化技术

临床医师

研究背景

正常组织来源的细胞在体外培养条件下可分裂生长，但经过有限次数的传代后，就会停止增殖，发生衰老和死亡，这种现象称之为海弗利克极限。有的细胞自发或受外界因素的影响，可以从增殖衰老危机中逃离，从而拥有无限增殖的能力，该过程称之为细胞永生化。然而自发永生化的几率非常小，啮齿类动物为10-5-10-6， 而人类细胞则更为罕见， 小于10-12。通过转染技术将外源性永生化基因导入目的细胞或诱导衰老相关基因突变，可以增加永生化的发生率，从而建立稳定的永生化细胞株。





技术简介

细胞永生化(Cell immortalization)是指体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离，从而具有增殖能力的过程。正常组织来源的细胞在通常的体外培养条件下可分裂生长，但经过有限次数的传代后，就会停止增殖，发生衰老和死亡。利用基因转染等技术将外源性永生化基因导入目的细胞内，从而建立永生化细胞株，以达到使体外培养的细胞具有增殖能力且细胞间无差异的目的。对细胞永生化进行深入研究，不只是有利于我们了解细胞增殖与衰老的分子机制，而且为探寻肿瘤治疗及器官移植的研究奠定了坚实的基础。此外，由于永生化细胞具有可以多次传代的特性，可以利用各种细胞永生化的方法使那些传代困难、增殖缓慢、容易衰老的细胞获得永生，从而为研究人员提供许多的细胞资源，为科学研究提供了良好的体外细胞模型。
哺乳动物细胞使用几种方法诱导细胞永生化。其中猿猴病毒40(SV40)T抗原和hTERT病毒诱导的细胞永生化最为简单可靠，应用广泛。





为什么要做细胞永生化


许多细胞永生化技术可以在体外为细胞系提供扩展的增殖能力，同时密切模拟体内细胞的生理学。与原代细胞不同，永生化细胞不易受复制衰老的影响，减少了重新购买和重新启动生长的需要，节省了时间和费用。
▪ 定制永生化服务产生的细胞系寿命更长，通常与原代亲本细胞相似
▪ 细胞永生化服务相结合，能够克服原代细胞有限的寿命
▪ 除了标准细胞认证测试，可以测试永生化细胞系的扩展增殖能力和从感兴趣的组织中选择表型标记(例如，hTERT的持续表达)
永生化细胞具有增殖能力，并具有与亲本组织相似或相同的基因型和表型，能够提供稳定均一、性状一致的细胞来源，其意义主要包括但不限于
►了解细胞生长规律，探索细胞衰老机制；
►体外研究细胞增殖、分化、调亡等的理想模型；
►有助于明确致癌物质的作用机制；
►体内外探究肿瘤发生机制的重要模型；
►为研究者提供更多且更丰富的细胞资源等。
操作流程





服务内容

原代细胞分离纯化
永生化基因的慢病毒制备
慢病毒感染原代细胞并进行培养
永生化混合细胞进行抗生素筛选
永生化细胞系进行端粒酶基因表达和衰老检测
服务流程

客户提供：原代细胞、干细胞、免疫细胞材料，您可以提供自主分离的特定原代细胞，也可以从我们的原代细胞产品中选择合适的目的细胞。
我们提供：建立永生化细胞株，以及提供建立方法，步骤及结果。
也可提供表型和功能的验证：永生化细胞系可以根据您的要求进行表型和功能的验证， 包括mRNA表达，蛋白质表达或功能测定。
周期：4-8 周
报价：私
公司优势

团队拥有成套完善的技术体系，进行稳转细胞株构建
制备的永生化细胞系纯度高，无污染
提供完整并准确的鉴定方案，鉴定报告真实可靠
拥有低成本、高效率的制备模式，极大缩短生产周期
项目案例







细胞永生化方法

细胞永生化的机制主要包括：理化因素作用所致的原癌基因活化/抑癌基因失活;端粒酶的稳定活化；具有致瘤性的病毒如SV40病毒、EB病毒、人乳头状瘤病毒HPV等。
一般而言，自发永生化的几率非常小，因此基于细胞永生化的机制，常通过转染技术人为地将外源性永生化基因导入目的细胞，或对抑癌基因进行敲除，或诱导永生化相关基因突变以增加永生化的发生率，从而建立稳定的永生化细胞株。
病毒基因转染

很多病毒感染能够诱导细胞永生化，例如EB病毒(epstein-barr virus, EBV)、猿猴病毒40 (simian virus40, SV40)和人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)。这些病毒感染其天然宿主细胞，能诱导细胞永生化。
EBV能使B淋巴母细胞永生化形成淋巴母细胞样细胞系，它是通过潜伏蛋白激活细胞因子与其受体相互作用的途径使细胞永生的。EBV永生化B细胞的一个最显著的特点是端粒酶活性的提高，这可能是导致B细胞永生的主要原因。目前，EB病毒介导的细胞永生化应用最多的是B淋巴细胞，其他细胞中的应用很少。
SV40是简单的真核细胞病毒，SV40的T抗原片段是最常用的目的片段，将其整合入靶细胞核内并表达，可导致细胞增殖活力的改变并表现出多种与肿瘤相关的转化显型。应用的方法包括：野生型SV40病毒共培养感染靶细胞、磷酸钙法、电穿孔以及逆转录病毒载体法等。
HPV已成功将人的包皮细胞、角化上皮以及乳腺、胰导管和口腔等的上皮细胞永生化。HPV病毒的早期表达蛋白E6和E7在细胞永生化中起决定性作用。E6和E7蛋白能够改变细胞的终末分化，诱导细胞进入S期，使细胞绕过正常细胞的周期检查点。
病毒法获得的永生化细胞往往发生细胞表型改变，而且一般只应用于病毒 的特定宿主细胞。由于该法将整个病毒基因组导入了细胞，因此，很容易使细胞转化为肿瘤细胞。
端粒酶激活

端粒酶是一种能延长端粒末端的核糖核蛋白酶，由RNA和蛋白质组成。端粒酶能以自身的RNA为模板，从端粒DNA3’-OH 末端延伸端粒或合成新的端粒DNA， 以补偿细胞分裂时染色体末端的缩短，从而维持端粒的长度，使细胞不会因端粒耗尽而出现凋亡。正常情况下，大多数体细胞端粒酶的表达是严格调控的，表达是瞬时和低水平的。在原代培养的细胞中稳定表达人端粒酶催化亚基(hTERT)基因能稳定端粒的长度，使细胞易于永生化，因此hTERT的激活是细胞永生化的重要步骤。虽然激活端粒酶活性能够使多种人和动物的细胞永生化，但是对于有些细胞，重建端粒酶活性并不足以使细胞永生化，还需要借助癌基因法。
癌基因法

一些原癌基因，如Myc, c-Jun, c-Ias, vsrc和Mdm2，通过基因转染可介导目的细胞永生化。c-Myc是最早被发现的原癌基因，有许多与瘤化相关的功能区域，其转录表达的蛋白通过核膜进入细胞核与端粒酶的启动子结合位点特异性结合，诱导端粒酶mRNA快速表达，直接激活端粒酶活性，促进细胞进入永生化。
细胞永生化过程中，抑癌基因如p53, pRb, BRCA1, DPC4等，通过等位基因隐性作用、抑癌基因的显性负作用等逐渐失去活性，细胞老化途径受阻。实验证明端粒酶的活性与抑癌基因表达产物的下调有相关关系，推测抑癌基因的失活协同端粒酶的激活共同参与细胞永生化进程。
目前有多种细胞永生化的方法，但不是每一种方法都可使一个特定的细胞 永生化。由于细胞的来源动物、组织不同，其细胞的增殖、分化调控也不尽相同，因此，每类细胞的永生化的分子机制不同，其永生化细胞的方法也不同。
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