有没有可以替代western blot 的实验方法？

病理医师

由于需要检测的蛋白没有合适的一抗 二抗，有没有其他的方法也可以检测蛋白的表达量

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蛋白免疫印迹一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。Western、Southern、Northern、Eastern、Southwestern blotting、Far-Western blotting这6大金刚在实验室实验技术中占据半壁江山，然而作为我们耳熟能详的莫数Western blot。


Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
下面这些图片就是Western blot实验的最终数据结果。

现在屏气凌神，带大家下天山

1、蛋白样品提取




（1）细胞中蛋白样品的制备：
细胞培养至80%左右密度时，经预冷的PBS漂洗3次，加入450μl裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，反复吹打。加入Laemmli 样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合），强力混匀，样品置100℃水浴箱里水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取出清液，将其移入另一洁净试管中。
（2）组织中蛋白样品的制备：
手术切除的组织块迅速置于预冷的0.95生理盐水中，漂洗数次，按组织净重，裂解液=1：10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清。加入Laemmli样品缓冲液强力混匀，样品置100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清液，将其转入另一洁净的试管中。
2、BCA法蛋白浓度测定
实验室大多都是采用赛默飞蛋白定量试剂盒。
A、检测原理:
其原理为：在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。
B、检测步骤：
. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀；   
. 各孔加入200μL BCA工作液；   
. 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20μL，加入BCA工作液200μL，充分混匀，37℃放置30分钟后，以标准已知浓度样品管做参比，在 562nm波长下比色，记录吸光值；
. 根据所测样品的吸光值，即可算出各个蛋白样品相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（20μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位: μg/μL）
3、PAGE胶的制备



4、蛋白样品变性和蛋白电泳




有一些抗体主要识别目的蛋白氨基酸序列上的一小段序列，但蛋白质的3D结构可能使被识别的序列被埋藏起来了，所以为了提高抗体的识别效率必须对蛋白质进行变性处理。上样缓冲液（Laemmli样品缓冲液）中的阴离子去垢剂SDS能使蛋白质变性，同时把蛋白质溶液置95-100℃中加热变性。电泳，一般选择恒压。最高电压不会超过120V。
5、转膜


要使夹的黑面对槽的黑面，夹的红面面对槽的红面。夹子黑的一面：海绵-3张滤纸-胶-NC膜-3张滤纸-海绵。一般选择恒流，最低电流以200mA开始,转膜时间根据目的蛋白分子量的大小适当调整转膜时的电流大小或转膜时间。


实验中，大家常见到和使用的印迹材质是NC膜和PVDF膜。转膜前一定要确认拿到手的是哪一种膜。


转膜后，为了能预先判断出蛋白的转移效果，也为了避免因转膜失败导致我们后期实验盲目的进行而节省时间和试剂、耗材。建议大家在这个环节多加一个丽春红染色实验。对于失败和重复的Western blot实验，我们有必要在蛋白电泳之后加上考马斯亮蓝染色实验，这样我们就可以很简单的知道蛋白的分布情况，这样大家就知道要检测的目标蛋白含量怎样，同时也有利于大家进行后续实验时能及时的调整实验条件。


若实验时间安排紧张，在当天做到转膜这一步时离下班时间只有1h，我们有两种方法：将电泳凝胶放到无水乙醇5 min，取出放到盛有适量无菌水的培养皿中过夜，第二天再进行转膜。另一种方法就是，过夜转膜，将连接电泳槽的电泳仪电压调到最低，第二天将电泳仪电压恢复常规进行转膜1h即可后续操作。
6、封闭
将膜完全浸泡在封闭液30min-12h(过夜也可)。在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂。
如果所检测的目的蛋白是磷酸化的蛋白的话，封闭液不能使用脱脂牛奶（因为脱脂牛奶中含有较多的磷酸化蛋白，很容易造成高背景结果）一般是使用5%的BSA溶液代替做封闭液。
7、抗体孵育
（1）一抗
孵育一抗时先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。一般采用室温孵育3-4小时，可根据抗体量适当延长或缩短时间。 然后用 TBST先快速洗三次，洗涤主要是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。
（2）二抗
孵育二抗，室温下孵育2小时，稀释比例为1:3000。二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。然后是再洗涤，用TBST先快速洗三次。
8、ECL显色
ECL显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。
鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光。


试验步骤：
A、将两种显色底物1：1等体积混合（一般各1ml/membrane）。
B、将混合物覆盖在膜表面，1-2分钟。
C、用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。
D、在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min。
E、显影、定影。
F、根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。


Western Blot 常归试剂
A.丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。储于棕色瓶，4℃避光保存。
B.十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1g SDS，1ml H2O去离子水配制，室温保存。
C.TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制。
D.SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5M Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮5min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
E.分离胶缓冲液。
F.浓缩胶缓冲液。
G.脱脂奶粉5%(w/v)。
H.Tween20。
WB实验整套流程下来仅需2天时间，但操作繁琐，需要科研人员全程把关，实验操作平台重污染区。很多人误认为WB实验在实验室属于边缘化实验。WB实验需要我们掌握的思维和技术恰恰被很多人忽略。CO-IP、IHC、FISH、ELISA、IF、胶体金免疫层析这些实验中都离不开Wesrern Blot的功劳。在这些众多实验中都有相关联的原理和操作步骤。Western Blot实验被广泛应用于蛋白质相对含量检测、蛋白质修饰水平分析、蛋白质相互作用研究。因此，大家在操作WB实验时应提高重视。


对于WB技术小白，我们先学会快速记住实验流程，怎么简单怎么来，念口诀：

清风寡欲

嗯，还是做一抗二抗的成本低

清风寡欲

质谱法虽然有半定量法和定量法，但是实际操作中多有不便。首先死贵，一般一次上样要1000刀左右（可能现在便宜了）。如果你要比较两个样品中的某种蛋白的丰度，可以进行标记后混合上样，那就需要至少三个上样。多于两个样品，可以直接测肽段丰度，每个样品至少三次上样。其次，每次上样得到的结果差异会比较大。如果是病例样本等有个体差异的样品，建议首先混合样本。否则，差异会大到你不知道是样品间有差异还是质谱结果有差异。另外，由于质谱是靠检测特定肽段来定量，如果这个蛋白本身丰度不高或者比较难以电离，其信号会被掩盖在其他蛋白的信号中，无法检测。所以，如果你有钱有闲，可以先尝试一下，不要抱太大希望。
那么实际一点的做法是什么呢？你的研究蛋白没有合适的抗体（应该是一抗），可能仅仅是没有合适做Westernblot的一抗。那么可以尝试ELISA，也可以尝试IFC染细胞或IHC染组织切片。有些抗体不能做Westernblot，但是可以做ELISA、IFC或IHC。如果实在没有，还可以联系生物公司或大学研究室做单抗或多抗，不一定很贵，现在技术比较成熟了。比如华大基因的单克隆抗体公司。最后的最后，如果实在都不成功，还可以检测mRNA水平，作为间接证据。

同花顺

可以用靶向定量蛋白组学来代替。

队长是我

样本直接跑普通电泳或者二维电泳，切胶打质谱，或者肽段测序，做蛋白质丰度检测。