技术 | 吹净黄沙始见金，从生物液体中读出疾病的征兆，液态活检逐步走向临床应用

病理医师

液体活检是一种新型的诊断工具，它从各种生物液体（如血液和脑脊液）中寻找疾病的迹象。
由于与组织活检相比，抽血容易，脑脊液的抽取相对容易，液体活检被誉为诊断和监测疾病进展以及评估治疗反应的一种微创方法。液体活检通过检测血液或脑脊液中的核酸、蛋白质、细胞和细胞外囊泡（细胞内容的包装）发挥作用。
液体活检通过分析这些生物大分子的性质来深入了解疾病的特征。例如，在癌症方面，这包括检测由生长中的实体肿瘤脱落到循环中的生物分子，即血液。这包括循环肿瘤衍生的无细胞DNA（cfDNA）和肿瘤衍生的循环肿瘤细胞（CTCs）。
如果确定了一个可操作的驱动突变，这可以提示潜在的治疗途径，如针对驱动肿瘤发生的酪氨酸激酶突变的酪氨酸激酶抑制剂。
肿瘤临床应用中首次亮相
2022年9月，使用「液体活检」一词在PubMed上进行搜索，得到了约10,550次点击，其中约7,260次或69%是在过去5年里发表的。因此，它是一项在广泛的学科领域中迅速发展的技术。
在这些应用中，癌症占主导地位，但其他几个医学领域也在积极研究，包括生殖医学中的产前检测、传染病中的病原体检测和宿主细胞相互作用，以及自身免疫性疾病，仅举几例。
此外，癌症中cfDNA的液体活检测试甚至已经进入了临床。美国食品和药物管理局（FDA）已批准对肿瘤来源的cfDNA进行若干液体活检诊断测试，作为检测各种癌症及其相应可操作突变的辅助诊断。因此，液体活检准备为患者的临床护理做出重大贡献，特别是在肿瘤学领域。
改变癌症检测和治疗的格局


大多数癌症类型的早期检测仍然是一个相当大的挑战。下载此信息图，了解更多关于液体活检的重要性、加强液体活检测序的目标捕获富集板以及液体活检的应用。
在过去十年里，堪萨斯大学（KU）医学中心病理学和实验室医学系教授兼基因组学诊断部门主任、KU癌症中心副主任Andrew K. Godwin一直在开发液体活检平台，分析肿瘤流出的各种物质，以改善病人护理。Godwin教授的工作在基础科学研究和临床领域之间架起了一座‘死亡之谷’。
Godwin教授解释了他研究背后的动机：“在转化医学被公认为是一个研究领域之前，我就开始参与其中。我职业生涯的一个主要重点是对病人样本进行分子评估，以帮助指导他们的治疗，主要是在癌症方面。我寻求能够加强早期检测的方法，促进诊断，并监测疾病负担和对治疗的反应。液体活检是实现这些目标的一个特殊工具。”
“当液体活检首次出现时，它们检测的是CTCs，然后发展到查看其他循环模型，如cfDNA，现在是最近的无细胞RNA。针对cfDNA的液体活检测试已经出现了爆炸性增长，在无法进行组织活检的情况下寻求肿瘤突变。”
除了在cfDNA方面的广泛工作外，Godwin在过去十年中对细胞外囊泡也产生了兴趣。
“毋庸置疑，cfDNA是一种优秀的肿瘤生物标志物。然而，我的理念是，我们可以通过检查肿瘤脱落的其他物质，如细胞外囊泡，从液体活检的综合方法中获得更多的信息。”

细胞外囊泡是由细胞释放的膜结合的包裹，它表达与它们的原生细胞有关的各种表面标记，并携带从RNA、蛋白质和代谢物的货物。

“根据其表面和货物内容，细胞外囊泡可以作为癌症生物标志物。例如，它们可以携带载有肿瘤突变的mRNA或与肿瘤病理生理学有关的生物分子。我们还可以利用它们进行早期癌症检测、诊断，确定肿瘤侵袭和耐药性的机制，并监测对治疗的反应。”


此外，Godwin实验室及其同事正在开发微流控平台，以分离循环癌症生物标志物，包括cfDNA或细胞外囊泡。微流控设备由微米大小的通道和腔室组成，通过快速操纵小体积的液体进行分析。
微流控平台为分离生物标记物提供了许多优势，因为它们将捕获或富集步骤（即cfDNA或细胞外囊泡）与分子分析和/或定量步骤相结合，可以在‘芯片’上进行。因此，它们简化了分析过程，。
Godwin教授对这项开创性的研究解释道：“微流控技术的另一个重要好处是能够以小体积工作，因此只需要极少量的病人生物流体样本。我们最近说明了使用微流控设备检测卵巢癌患者仅2微升血浆中的外泌体的可行性。”
卵巢癌是很难早期发现的。它被称为‘低语的癌症’，它的症状表现往往被女性所忽视。不幸的是，在诊断时，它通常是广泛的，使得它难以治疗，预后不佳。对20名卵巢癌患者与10名年龄匹配的对照组的血浆分析表明，表达叶酸受体α的细胞外囊泡有可能作为早期检测和进展的生物标志物。
Godwin教授和他的研究团队还在调查液体活检对尤因肉瘤家族肿瘤（简称ESFT）的潜力。ESFT是一种骨骼或软组织的癌症，其分子特征是染色体易位EWS-ETS。
“尽管EWS-ETS易位是ESFT的一个强有力的分子诊断，但不幸的是，它需要对肿瘤进行组织活检，而这可能是痛苦的或无法达到的。液体活检可以提供一个潜在的解决方案。我们可以从细胞模型中检测EWS-ETS mRNA，最近还证明了细胞外囊泡中的蛋白质组特征对诊断ESFT的作用。”
Godwin教授继续推动他的研究，进行纵向研究，以评估液体活检在风险人群中早期检测的效用，如BRCA1和BRCA2突变携带者。他在谈到最终目标时说：“我可以设想一种快速而敏感的液体活检测试，用于筛查卵巢癌风险增加的妇女。技术推动科学，该测试最终可能以即时检测的形式进行，病人在年度检查时将直接得到他们的结果。”
用于器官损伤检测


尽管癌症生物学和肿瘤学领域构成了液体活检研究的主体，但也有研究追求在其他领域扩大应用。
“液体活检对于广泛的诊断应用是有用的。”，康奈尔大学生物医学工程教授Iwijn De Vlaminck阐述了他的研究，“除了癌症之外，液体活检还可以用来监测器官损伤，这是我们非常感兴趣的一个领域。”
器官损伤可能发生在移植后以及感染性或免疫相关疾病和并发症期间。液体活检方法具有监测器官损伤的几个优势。
首先，它是微创的，对病人造成的不适较少，因此可以在纵向监测中采用。
其次，液体活检可以通过利用分子技术对受伤器官释放到生物流体中的cfDNA分子进行定性和定量，以非靶向形式应用。
具体来说，De Vlaminck教授和他的团队根据不同的分子特征来确定cfDNA来自哪些器官。
“器官损伤是一种常见的现象，在各种疾病过程中发生。受伤器官的坏死或凋亡细胞将cfDNA溢出到血液循环中，我们对其进行检测和分析，从而产生关于受影响组织和器官的大量信息。器官损伤可能发生在器官衰竭末期或血液病癌症患者的移植手术之后。感染会引发炎症反应，从而导致器官损伤。”
在早期的工作中，De Vlaminck教授证明了在心脏和肺部移植的器官受体的血浆中可以识别出捐赠者来源的cfDNA。在这两种情况下，对纯化的cfDNA进行了测序，以定量归属于器官捐赠者的部分，这与组织活检的宿主排斥反应呈正相关。
器官受体被置于免疫抑制方案中，以降低移植排斥的风险，不幸的是，这提高了病人对感染的易感性。事实上，巨细胞病毒、疱疹病毒和腺病毒的序列存在于非人类的cfDNA中，表明可能存在感染。


“最近，我们发表了一篇文献，报告了一个全面的液体活检平台，对异体造血细胞移植受者的cfDNA进行血液学恶性肿瘤检测。我们利用cfDNA甲基化特征来追踪组织来源，精确指出受体中的器官特异性损伤，并分析捐赠者与受体之间的cfDNA比例来评估移植排斥。”
De Vlaminck教授解释说。
“同时，我们确定了肿瘤来源的cfDNA的突变，以评估癌症复发，并进行cfDNA元基因组分析以评估感染。对27名造血细胞移植受者的170份血浆样本的分析发现，移植后一个月内，实体器官来源的血浆cfDNA升高，表明普遍的器官损伤，与移植物抗宿主疾病相关，这是受者偶尔发生的免疫并发症。此外，以前的研究结果被复制，较高的供体cfDNA分数可预测移植物排斥反应，并且可以检测到病毒感染和癌症复发。”
De Vlaminck教授实验室的另一个重点是作为感染性疾病后果的器官损伤。
"我们对患有和未患有细菌或病毒性尿路感染的肾移植受者的尿液样本做了研究。当然，我们使用尿液cfDNA的元基因组分析来检测感染性病原体，正如预期的那样。然而，与此同时，我们还发现了甲基化的cfDNA特征，表明在尿路感染患者中，病毒和细菌引起的肾脏和膀胱组织损伤，"De Vlaminck教授总结了这项研究。
De Vlaminck教授和他的团队还利用他们基于cfDNA甲基化特征的液体活检平台，监测器官损伤，作为COVID-19患者感染严重程度的替代物。
在谈到他的研究动机时，De Vlaminck教授说：“在这一流行病的早期，很明显需要有诊断工具来评估COVID-19感染的严重程度，这些工具侧重于病人的状况。因此，我们调查了COVID-19患者与其他病毒感染患者和健康对照组的血浆样本中器官损伤的cfDNA特征。怀有暗示肺、肝和红血球祖细胞损伤的甲基化特征的cfDNA与严重的COVID-19有关。cfDNA总量与世界卫生组织疾病进展的序数表有关，并且在插管的病人中明显升高。”
De Vlaminck教授认为，液体活检中的cfDNA所持有的信息在研究中可能非常有用，并最终用于临床。
“我们的目标是建立一个可推广的液体活检平台，以确定器官损伤的数量和位置。这将是一个微创的、快速的、非靶向的诊断工具，它可以在一次测试中产生一个病人器官损伤的全面图像。”
在过去的几年里，液体活检已经从研究领域迅速发展到临床，以cfDNA作为癌症的辅助诊断。然而，研究继续扩大可用于液体活检的肿瘤来源内容的范围，有可能得出更多信息。此外，研究人员在癌症以外的领域追求液体活检平台，以扩大医学的潜在应用。
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