分子诊断:qPCR/NGS/数字PCR技术

千姿百态

分子诊断是将分子生物学技术应用于疾病诊断的医学分支学科，利用分子生物学技术研究人体内源性或外源性生物分子的存在、结构或表达调控变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗、预后和转归提供信息和决策依据。精准医疗的发展，将持续推动分子诊断的进步。
目前常见核酸分子诊断技术涉及三个技术：荧光定量PCR技术（qPCR）、高通量测序技术（NGS）和数字PCR（ddPCR）。在实验过程中，选择哪种检测技术才能更好的达到预期结果？下面我们就来简单介绍一下。


从各类技术类别来看，PCR技术由于壁垒相对较低，国产化程度高，国内企业布局相对较早，因此基于PCR技术的分子诊断产品占总产品量的70%以上。
PCR技术是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，基本原理是在反应室中模拟细胞内的DNA复制，即人为创造核酸半保留复制条件，使目的DNA在细胞外完成扩增的过程。通过PCR技术进行分子诊断的流程如下：核酸提取——核酸扩增——核酸检测。
按照靶标数量划分，PCR技术平台通常可分为qPCR和ddPCR。


荧光定量PCR技术（qPCR）

在1983年，美国人Mullis发明了聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction, PCR),这一技术将DNA的变性原理以及复性原理加以利用，采用适温延伸、高温变性以及低温复性，让核酸片段实现了体外扩增，可将极微量的目标DNA特异地扩增上百万倍，从而提高对DNA分子的分析和检测，因为PCR有着很高的灵敏度以及特异性，而且简便快速，所以这种技术已经成为目前临床基因扩增实验室接受程度最高的技术。
qPCR通过荧光染料或荧光特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程。每扩增一条DNA链，就有荧光染料分子结合到双链DNA上或有荧光分子从探针上释放，实现荧光信号的累积。由于荧光积累与PCR产物形成完全同步，可通过软件对荧光积累信息进行分析和计算，获得待测样品模板的初始浓度。但是，qPCR只能够通过标准曲线和标准品进行相对定量，无法做到精准绝对定量。
数字PCR技术（ddPCR）

ddPCR系统利用油包水技术，在传统的PCR扩增前将一个大的反应体系进行微滴化处理，将此反应体系分割为成千上万个微滴，即成千上万个独立的PCR反应体系。在此过程中，样品被稀释至单分子水平，并被平均分配到这几万个反应体系中，每个微滴中不含或者含有至少一个待检测的核酸靶分子，这样也相当于变相的对靶基因进行富集。
PCR技术可直接获得DNA分子的拷贝数，实现起始样品中核酸分子的绝对定量，且无需标准品或内标。数字PCR已经被广泛应用到医学、生物学等各个领域，如拷贝数变异、突变检测、复杂来源样品中低丰度核酸分子检测、NGS数据验证、miRNA等微小差异表达研究、单细胞基因表达分析等方面，在已知突变的癌症分子标志物的检测、传染病病原体检测、基因组三倍体分析和基因表达分析等领域展现了强大的优势。
高通量测序技术（NGS）

NGS可以一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。在基因组水平上，NGS可进行从头测序而获得该物种的全长序列，为后续研究奠定基础；对已知参考序列的物种，进行全基因组重测序可检测新的突变位点，发现个体差异的分子基础。在转录组水平上，NGS可进行全转录组测序，开展可变剪接、基因表达差异、新非编码RNA分子发现等研究。
NGS与染色质免疫共沉淀和甲基化DNA免疫共沉淀技术相结合，可检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。NGS功能强大，适合用于探索筛选新的生物标志物，但是实验操作较复杂，数据分析难度较大，检测周期长，成本较高。
qPCR、ddPCR、NGS三大技术对比分析



从以上对比分析来看，数字PCR因为灵敏度高、绝对定量、适合于医院操作等优点，在肿瘤液体活检、无创产前筛查、感染性疾病早期诊断等临床检测应用方面具有显著优势。NGS在检测未知序列、未知突变、高通量多位点检测方面是更好的选择，是科研和独立实验室服务的好工具。qPCR适用于较常规的临床分子诊断项目。
总的来看，分子诊断技术的应用不仅深化对疾病发病机制分子生物学的基础研究，而且不断扩大了分子诊断疾病的病种，随着人类基因组计划的完成和蛋白质组计划的启动，分子诊断方法将极大地推动现代检验医学的迅速发展，并通过这些基本技术的衍生、联合产生新的分析方法，从而提高分子诊断的特异性、敏感性和准确性，为临床医学诊断和治疗提供更准确的数据和信息。


作者：海星生物
公众号：海星生物科技
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