Nature | 原子水平高时空分辨率DNA酶结构全解析

Rose

撰文 | 十一月

一提到酶，你会想到什么？活细胞产生的、对底物具有高度特异性以及高度催化的能力的蛋白质或者RNA（Ribozymes）。但是目前为止自然界中尚未发现有DNA酶的存在。不过目前已有几种不同的、具有催化活性的单链DNA序列通过体外选择发掘出来，并被命名为DNA酶（DNAzymes），DNAzymes能够催化的各种不同的化学反应【1,2】。DNAzymes其中一个的功能是可以切割RNA，因此可以靶向以RNA为基础的病毒，或者在非编码RNA以及某些蛋白质表达水平升高的相关疾病中充当“基因沉默器”（图1）。



图1 DNA催化RNA的切割【2】
DNAzymes包括一个催化核心序列以及两个位于两侧的底物结合臂（图1）。核心序列负责催化RNA裂解成两个片段，底物结合臂可以被设计成具有高选择性的识别给定的目标序列。其中10-23 DNAzyme是最强力的RNA切割酶，但是其催化过程中的相关状态的高分辨率结构特征还尚不清楚。
2021年12月23日，德国杜塞尔多夫大学Manuel Etzkorn研究组发文题为Time-resolved structural analysis of an RNA-cleaving DNA catalyst，以10-23 DNAzyme作为范例研究了该DNA酶在预催化状态到催化过程中高时空分辨率的分子结构以及可塑性动态变化过程。




为了开始这一研究，作者们使用了10-23 DNAzyme，该DNA酶具有催化核心以及底物结合臂，但其中催化环内的回文序列会导致无活性二聚体的形成，这也就是以前很难进行结构检测的原因【3】。所以作者们首先尝试几种突变方案，可以破坏回文结构的形成。在没有二价金属离子的存在下，作者们发现DNAzyme与RNA底物可以形成稳定的预催化复合体结构。另外可以通过在RNA底物中引入氟取代来稳定RNA的结构，从而表现出优异的核磁共振光谱特性。总的来说，A5C的突变方案消除了与回文序列相关的二聚化风险、维持了活性、增加了核磁共振可及性。
随后，作者们在二价镁离子存在情况下对10-23 DNAzyme的分子结构进行揭示，同时也对不同二价金属离子在DNAzyme中发挥的作用进行了探究。10-23 DNAzyme中包括三个金属离子结合位点，其中金属离子在10-23 DNAzyme中的第二个金属离子结合位点中起到激活作用。
为了进一步理解DNAzyme介导催化的作用的步骤、构象变化以及限制因素，作者们对DNAzyme的各种状态进行了表征（图2），从而揭开其中包括初始分子结构、不同构象的可塑性以及其中金属离子对其酶活性的动态调控。另外，通过单位点替换，作者们实现了对DNAzyme活性的提高，证明所得到的分子构象对于调制DNAzyme酶的活性的确具有重要的指导意义，为合理设计具有RNA靶向切割活性的DNAzyme提供了一个有价值的起点。



图2 10-23 DNAzyme各种状态的结构表征

总的来说，该工作首次揭示了原子水平以及高时间分辨率的DNAzyme分子构象，实现了对DNAzyme发挥酶活性更深层次的理解。DNAzyme作为临床治疗策略，具有高选择性、设计简单、尺寸较小、生产成本低等优点，因此如果能够根据结构进行优化和筛选将为快速实现临床应用提供抓手。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04225-4

参考文献
1 Santoro, S. W. & Joyce, G. F. A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94, 4262-4266, doi:10.1073/pnas.94.9.4262 (1997).
2 Silverman, S. K. Catalytic DNA: Scope, Applications, and Biochemistry of Deoxyribozymes. Trends in biochemical sciences 41, 595-609, doi:10.1016/j.tibs.2016.04.010 (2016).
3 Nowakowski, J., Shim, P. J., Prasad, G. S., Stout, C. D. & Joyce, G. F. Crystal structure of an 82-nucleotide RNA-DNA complex formed by the 10-23 DNA enzyme. Nature structural biology 6, 151-156, doi:10.1038/5839 (1999).
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