流式细胞术

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实验目的：
掌握流式细胞仪的工作原理
掌握用流式细胞仪测量细胞群体DNA含量分布的方法
了解流式细胞术在细胞生物学研究中的应用
实验原理：
细胞被荧光标记（直接标记，或者与单克隆荧光抗体标记）制成细胞悬液（一定浓度），通过仪器的样品管，在气体的压力下进入流动室，流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列从流动室的喷嘴高速喷出成为单细胞液柱。液柱与入射激光垂直相交。相交点为测量区，测量区的细胞被激光照射后产生散射光和激发荧光。散射光与荧光穿过滤光片，被光电倍增管或光电二极管接收并转化成电信号，这些信号经加工处理储存于计算机中，用专门的计算机软件对其储存数据进行图象显示、分析、统计运算。
染色原理：PI可选择性地嵌入DNA分子双螺旋的碱基之间，经激光激发后发出橙红色荧光，其荧光强度与细胞DNA分子含量呈比例关系，因而可用于DNA倍体及细胞周期分析。
细胞上标记的荧光物质被激发所产生的荧光强度与结合在细胞上荧光色素分子的数量成比例关系。
细胞周期中，G0/G1期是2倍体，G2期是四倍体，S期则处于两者之间，所以可以根据测得荧光参数不同分期各期细胞的百分比。
仪器、材料与试剂：
仪器：流式细胞仪、离心机。
材料：大鼠肾小球上皮细胞、试管、离心管、封口膜、微量移液器、Tip头、Eppendorf管、300目滤网。
试剂：70%乙醇（4℃保存），无Dnase的RNaseA储液，RnaseA 5mg加5 mlPBS溶解，PI染液：PBS27ml，RnaseA储存液5ml，PI2.5mg，Triton-X-100 0.25ml，加PBS至50ml，4℃避光保存数月。将PI溶于PBS（ph7.4）中，终浓度为50ug/ml。 PBS（4℃pH7.4保存）
实验步骤：
1.收集细胞，1000rpm/ min离心5min，弃去培养液。
2.冷PBS洗涤2次，离心收集细胞，以2 ml 70%的冷乙醇4℃固定24小时以上。
3. 1000rpm/ min离心5min收集固定后的细胞
4.PBS洗涤一次，1000rpm/ min离心5min收集固定后的细胞
5. 细胞用400ul PBS（PH7.3）重悬。加上述配置PI染液50ul，室温避光孵育30min
6.将PI染色和RnaseA消化后的细胞悬液用300目滤网过滤后上机检测。
7. 用488nm的氩离子激光管，测前向、侧向散射光和红色荧光（包括area峰，peak峰，width峰）。使用ModFit LT软件分析结果。
实验结果：
G0/G1 期：40.67%   G2期：19.08%  S期：40.31%    CV：7.17%
讨论：
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个微粒（如各种细胞、微生物及人工合成微球等）的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，同时可以对特定群体加以分选。流式细胞仪（Flow Cytometer）集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。适用范围：任何存在于悬液中的直径为0.2-100 微米的粒子或细胞都适用于流式分析。
DNA含量在细胞内所有参数中比较恒定，在细胞周期DNA含量随各时相发生周期性变化。如果DNA含量发生微小的异常变化，则有可能导致恶性肿瘤细胞的产生。细胞癌变过程中伴随细胞DNA含量的改变，DNA非整倍体细胞是恶性肿瘤的特异性标志。根据DNA分布直方图，可对细胞周期的分布状态进行分析，可计算出G0/G1 ％；S %；及G2/M ％。了解细胞的增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖生长的指标。

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