实验室祖传！Western Blot 实验全流程步骤+常见问题解决方案！

John

正在做或准备接触 Western blot 实验的同学可以认真阅读这篇文章，实操每一步做什么、怎么做、要注意什么都写的非常详细，包括会遇到的实验问题也写了非常详细的解决方案。
我走过的弯路大家就不要再走了，祝大家实验顺利！
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WB，是Western blotting的缩写，即蛋白质印迹法，又称免疫印迹（immunoblotting）,也就通过电泳技术分离不同组分，再采用印迹技术将蛋白质转移（“印”）到特定的膜上，再利用抗原-抗体的特异性结合原理，用抗体作为探针去实现检测复杂样品中的靶标蛋白的方法，这项技术也可以用来检测不同时期蛋白表达的水平以及蛋白相互作用等方面。


实验原理和用途
原理：通过电泳区分不同的蛋白组分，并转移至固相支持物，通过特异性抗体作为探针，对靶蛋白进行检测。


用途：定性检测，判断目标蛋白有无表达，目标蛋白分子量大小。常配合ELISA、FACS、IHC、IF等手段使用。

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一、WB标准流程

样本制备→凝胶电泳→蛋白转膜→封闭→抗体孵育→检测显影


1.样本制备

1）实验前需要清楚的重要信息

• 所用的细胞／组织中表达需要检测的靶标蛋白吗？
  
• 表达丰度如何？是否在WB的检测范围内？
  
• 靶蛋白的亚细胞定位是哪里（在核还是在膜或者其它位置）？靶蛋白分子量是多少（分子量决定了电泳胶浓度以及转膜大小）？
  
• 是否需要特殊刺激才会表达？（有些蛋白无刺激不表达）
  
• 是否在疾病组织或细胞中才会有表达？
  
• 是否有多种异构体？是否有多种翻译后修饰形式？（决定抗体的选择）
  

利用数据库查询重要信息：

Uniprot：http://biogps.org/#goto=welcome
解靶标蛋白基因信息、别称、功能、可变剪切、定位及可修饰类型等
Proteinatlas：https://www.proteinatlas.org/
通过IHC提供基因在正常组织和肿瘤组织中的表达变化和定位
BioGPS：http://biogps.org/#goto=welcome
不同样本中基因的mRNA表达水平和靶标蛋白的表达水平
PAXdb：http://pax-db.org/
不同物种组织和细胞中蛋白丰度
DepMap：https://depmap.org/portal/
肿瘤细胞mRNA表达量

除了在数据库内查询目标蛋白信息，也可以在参考文献中找到相关蛋白的信息。

2）样本制备流程
① 样本获得：组织或细胞取材
② 样品裂解：从组织或者细胞中释放获取蛋白
③ 蛋白定量：获悉蛋白浓度，为后续电泳步骤提供上样量依据
④ 蛋白变性：使蛋白变性形成线性结构，方便跑胶和抗体结合

处理细胞--抑制剂与激动剂
靶标蛋白可能需要进行刺激才会表达，这时候就需要找到合适的细胞处理条件。

参考文献
产品说明书
预实验

部分蛋白的处理方法，仅供参考


蛋白酶和磷酸酶抑制剂

• 内源性和外源性的蛋白酶会在细胞或组织裂解后迅速降解蛋白。
  
• 在细胞裂解的步骤加入蛋白酶抑制剂混合物可确保蛋白免于降解，磷酸酶抑制剂可以保持蛋白的磷酸化状态。
  

蛋白酶和磷酸酶的成分组成


获得高质量的裂解物
根据情况，结合超声、匀浆等物理方法，配合去垢剂裂解。
超声去除裂解样品中DNA干扰，经过超声处理过的样本得到的结果更清晰。


尽量使用新鲜的样品，新鲜的样品制备提取物背景较低。


细胞组分分离
细胞组分分离（cell fractionation ）是指把细胞的各种细胞器或不同组成成分分离的过程，方便快速的分离细胞组份用于下游分析。

产品推荐：Cell Fractionation Kit  #9038

试剂盒组成


细胞组份分离纯度检测抗体套装，提供一站式解决亚组份分离鉴定方案：

产品推荐：Cell Fractionation Antibody Sampler Kit  #11843

不同的亚细胞定位上蛋白的表达不一样，因此在实验前就应该确定目标蛋白的亚细胞定位。


蛋白定量
凝胶电泳时，要求蛋白的上样量尽量一致，后续的结果才更加可信。
为了后续在WB曝光的时候作为内参保持一致的前提。
定量方法有以下方式：


目前主流的蛋白定量方法是BCA检测法，去垢剂兼容性更强。
蛋白浓度测定试剂推荐：

产品推荐：BCA Protein Assay Kit  #FMS-W-002
产品推荐：考马斯亮蓝（Bradford）法蛋白定量试剂盒 #FMS-W-001

蛋白变性
普通的SDS-PAGE上样缓冲液组分：SDS、还原剂、甘油、染料以及Tris-HCl（pH6.8）等。
其中最重要的是需要了解溴酚蓝的作用为示踪。


膜蛋白注意事项：
跨膜蛋白有二硫键形成和糖基化等翻译后修饰。请尝试如下条件：

• 在loading buffer 中加入还原剂，如beta 巯基乙醇，不要煮沸，使用低于70°C的温度，孵育30-60 min。
  
• 样品制备的建议
  

2.凝胶电泳

1）凝胶及电泳液准备
2）上样
3）电泳

• 主流凝胶：不连续凝胶-浓缩胶/分离胶
  

在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而Cl离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。



如何选择凝胶浓度
凝胶的分辨能力由凝胶的孔径决定，孔径由浓度共同决定。原则有2点：

高比例的凝胶具有较小的孔径，用于分离分子量较低的蛋白。
低比例的凝胶具有较大的孔径，用于分离分子量较大的蛋白。

如何选择凝胶类型？


制备凝胶
pH值正确，妥当的保存，APS需新鲜，现配现用。



保持所有装置清洁。



分离胶勿倒过满，给浓缩胶留一定的距离。



凝胶需缓慢凝固，胶太硬电泳时易烧。


上样
将样本加入到样本孔中




蛋白marker
为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，在电泳时通常要使用预染的蛋白分子量标准（蛋白预染Marker）。

产品推荐：彩虹预染marker  (5-245 kDa)  #FMS-WB003

电泳
蛋白质现在带有负电荷，在电流作用下由负极向正极移动。

产品推荐：Tris-Glycine SDS Running Buffer (10X)  #FMS-WB032

电泳仪
电泳仪优势：2膜/4膜、兼容性高、性价比高、配件适配性高。




3.转膜

1）转膜
2）效率验证
膜的选择




转膜的方法
转膜有湿转；半干转；干转，湿转是转膜最完全、应用最广泛的方法。





转印仪器



转膜效率验证
带负电荷的丽春红染料能够与膜上带正电的氨基酸发生可逆结合，以判断转膜效率。

CST相关产品推荐：Ponceau S Staining Solution  #59803

转膜中的要点与建议


4.封闭

转膜完成后要用高蛋白的封闭剂对膜进行封闭，目的是防止抗体和膜发生非特异性结合。

化学发光法：含5% 脱脂奶粉的TBST
荧光法：含5% 脱脂奶粉的TBS

条件：室温封闭1小时
福麦斯相关产品推荐：

脱脂奶粉 #FMS-WB020；
BSA  #FMS-WB021；
Animal-Free Blocking Solution (5X)  #15019

5.抗体孵育/检测

1）抗体稀释
2）一抗孵育
3）洗涤
4）二抗孵育
5）洗涤
6）检测

稀释缓冲液--依赖于特定的抗体
含5%BSA或5%脱脂奶粉的TBST缓冲液。
说明书确认抗体的最佳稀释液。

一抗孵育--过夜孵育会改善抗体结合
建议一抗4度孵育过夜。



内参蛋白选择原则




http://www.ptgcn.com/media/qwyjpvc3/experimental-technical-manual-v5.pdf

内参蛋白选择指南
注意：没有一种内参蛋白，适用于所有样本的Western Blot，要根据自己的样本选择合适的内参。




洗涤
洗涤缓冲液

建议使用TBST进行抗体稀释和洗涤。洗涤三次，每次5-10分钟。
对于图中所有抗体，TBST比PBST可以产生更强的信号。

二抗孵育
较强的封闭剂稀释二抗可降低背景，建议用含5%脱脂奶粉的TBST稀释二抗。
如下图，用5%脱脂奶粉的TBST稀释二抗比BSA背景更低。


IP后蛋白进行WB实验，可使用构象特异或链型特异二抗，以避免IgG重链或轻链的干扰：

产品推荐：Mouse Anti-rabbit IgG (Light-Chain Specific) (L57A3) mAb  #3677；
产品推荐：Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb  #3678；
产品推荐：Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate)  #5127

检测--ECL发光
化学发光法--市场占用率最广泛的高灵敏度检测方法。
ECL发光液：指一种具有较高的化学发光强度的试剂。
一般使用的发光液A和B，在辣根过氧化物酶（HRP）的催化作用下，A液和B液反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体，当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。


WB加速神器--SNAP i.d. 2.0
使用WB加速神器--SNAP i.d. 2.0，30分钟可以完成实验。






Snap i.d. 原理



Snap i.d. 与传统方法下的实验结果对比


Western Blot 基本步骤回顾



二、Western Blot常见问题及解决方案

正常条带示例


问题1：无特异性条带

一抗二抗是否使用正确？

• 种属：一抗是否适用于样本种属；二抗是否匹配一抗？
  
• 孵育时间和用量不足
  
• 如没问题，4度过夜 抗体浓度提高2-4倍
  

蛋白上样量是否足够？

• 蛋白上样量过低，需要增加上样量
  

转膜是否充分、完全、过度？

• 充分：膜与转膜缓冲液浸润以及和胶的充分接触，可用丽春红S检测，避免甲醇浓度过高抑制蛋白转移
  
• 完全：分子量越大时间越长
  
• 过度：小分子量的降低转膜电压或时间
  

洗膜或封闭过度

• 降低洗膜次数
  
• 更换或降低封闭剂浓度，减少封闭时间
  
• 更换抗体稀释液，由脱脂奶粉换成BSA
  

问题2：高背景（有条带但是背景不正常）

一抗或二抗问题

• 降低抗体浓度和孵育温度
  
• 避免抗体和封闭剂的非特异性结合（磷酸化抗体和牛奶）
  

封闭不完全

• BSA换成5%脱脂奶粉
  
• 提高牛奶浓度
  
• 延长封闭时间
  

洗涤不充分（非特异性结合没有被完全洗掉）

• 提高洗涤次数
  
• 提高吐温20浓度
  

曝光时间过长（条带过黑过粗）

• 减少曝光时间
  
• 延迟曝光时间
  

膜的选择（当背景还是很高）

• NC膜>PVDF膜，相比之下NC膜背景更低
  

蛋白降解

• 加入蛋白酶抑制剂（可以翻倍加）
  
• 制样冰上操作
  
• 用新鲜样本
  

上样量过多（条带粗1秒曝出）

• 减少上样量
  

问题3：条带大小不正确

多聚体或蛋白降解

• 增加还原剂（DTT）
  
• 充分变性
  
• 尽量使用新鲜样本
  
• 减少冻融次数（反复冻融会导致蛋白降解）
  
• 新鲜样本、冻融前加入蛋白酶抑制剂
  

多个亚型存在（Isoforms）

• 查阅文献
  
• 工具网站：Uniprot（https://www.uniprot.org/）
  

多个修饰位点

• 磷酸化、乙酰化、泛素化、甲基化、糖基化
  

Marker 条带有偏移

• 看内参的条带位置（根据内参的位置判断目的蛋白的位置是否争正确）
  
• 换marker
  

问题4：显色不均匀，负片

蛋白量过多

• 降低蛋白上样量
  

一抗二抗浓度过高

• 加大抗体稀释度
  

问题5：不均一污点或气泡

膜上有气泡

• 轻柔去除膜上气泡，在转膜时尤其注意
  

设备污染

• 确保电泳仪清洗干净（遗留蛋白或胶碎片）
  

孵育或洗涤时溶液不足

• 确保在抗体孵育和洗涤时膜充分浸润
  

孵育时震荡不均匀

• 确保摇床或振荡器均匀摇晃
  

封闭液（牛奶）

• 牛奶要混匀，避免颗粒（建议转膜时就配好牛奶）
  

问题6：条带弯曲，拖尾，形状怪异（如呈现哑铃状）

样品盐离子浓度高

• 稀释；脱盐、透析
  

样品核酸污染

• 超声；核酸酶处理
  

样品有不溶物

• 稀释；充分裂解；离心
  

样品过多

• 蛋白定量；样品稀释；减少上样量
  

凝胶制备不均匀

• 核实胶配方，重新制胶
  
• 凝胶冷却不均一，电泳槽老化：重新配胶，更换电泳槽
  
• 分离胶与浓缩胶界面不平，可以使用异丙醇或乙醇来进行封胶，之后需要用水进行润洗，另外做好分离胶后要注意立即封胶
  

缓冲液离子强度不对

• 使用新鲜配置缓冲液
  

电泳问题

• 电泳停止过久：尽快进行转膜
  
• 迁移过快+电泳温度过高：降低电压或低温电泳
  

问题7：空白或者只有细微条带

一抗加错

• 一抗加成其他抗体
  

二抗种属错误

• 如兔的加成鼠
  

蛋白上样量太少

转膜问题

• 膜放反
  

问题8：条带重影

荧光强度比较高

• 在压片时，放好之后不小心又轻微移动了一段距离
  

问题9：非均一性背景（注意与高背景区分）

膜可能曾经干过

• 注意蛋白面不要风干
  

其他问题

溴酚蓝拖尾

• 样品溶解有问题
  

溴酚蓝弯曲

• 内槽漏液导致回路断开
  
• 底部的封条未撕掉
  
• 电泳电压过高，电泳温度过高
  

纵向的纹理

• 上样样品中存在不溶性颗粒，可以进行过滤
  

溴酚蓝很粗

• 浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错；
  

在分离胶中跑不动

• Tris-Cl PH值不对，或者忘记加SDS。
  

三、WB条带灰度分析工具

Western blot是显示蛋白丰度相对变化的半定量方法，通过分析信号强度，可以确定样本中目标蛋白的表达量相对于其它样本（如对照组、模型组）是增加还是减少。将目标蛋白条带发出的信号使用软件进行分析，计算出目标蛋白的相对定量值，即为WB定量。
对WB条带进行定量方法之一是灰度分析，灰度是计算机图像分析仪根据图像颜色深浅分为256个级别。灰度值越小物体颜色越深。
常用的蛋白灰度分析软件有 Image-Pro Plus ，Quantity One ，Image J/fiji。（还有不太常用的还有Gel-Pro Analyzer、Image Lab等）。
以下两篇文章内分享了所有灰度分析的安装包，可以下载后免费使用！

所有WB条带灰度分析工具的安装包下载：顶级图像分析工具，ImageJ、Fiji、Image pro plus，一次帮你搞定全部！
最好用的WB条带灰度分析软件盘点，Image-Pro Plus 、Image J/fiji、Quantity One... - 知乎 (zhihu.com)

不同软件测量值不同，即使相同软件重复测量数值也不一定相同，因此只要测定数值能反应目的蛋白变化趋势，测量值相对偏差不大即可。不同的软件各有千秋，大家可以综合考虑再做选择。

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