Cell子刊: 肿瘤液体活检新趋势——cfDNA甲基化

病理医师

“滴血验癌”是人类长期以来的梦想。俗话说一滴水就是一个世界，而血里面究竟蕴含哪些来自肿瘤的信号？我们该如何检测并破译这些信号，最终将肿瘤“绳之以法”？不久前，中山大学附属肿瘤医院院长徐瑞华教授团队在 Cell 子刊 Trends in Molecular Medicine (IF=11.953)  上发表综述，系统性地解读了游离DNA的甲基化在肿瘤液体活检中的进展。


以下我们将从以下四个方面进行解读：


什么叫肿瘤液体活检、cfDNA、ctDNA及甲基化？

2020 年全球癌症新发 1930 万人，死亡 1000 万，是全球新冠死亡人数的 2.3 倍。肿瘤的早发现和早干预对于肿瘤的防治至关重要。相比于欧美国家，在中国很多肿瘤发现即是晚期，一个重要的因素是肿瘤早期检测的普及还远远不够。人们为何不去做更多的检测将肿瘤扼杀在萌芽阶段？除了健康意识不够，肿瘤早期检测项目繁杂、过程痛苦、成本高等因素都严重打击了公众的检测积极性。有没有简单易操作的、微痛/无痛的、价格低廉的肿瘤检测方法呢？液体活检众望所归。
液体活检是指通过微创或无创的方式收集血液或其他体液（包括尿液、腹水、胸腔积液等），并对其中肿瘤相关的物质进行分析的一种检验方式。人体是一个系统，肿瘤细胞跟正常细胞一样会经历“生老病死”。肿瘤细胞凡是出现过，就一定会留下蛛丝马迹——肿瘤细胞本身或死亡的肿瘤细胞被分解后被释放到体液中。
那么体液中究竟有哪些来自物质呢？以血液为例，除了正常的红细胞、白细胞、来自正常细胞的游离 DNA (cell free DNA, cfDNA)，还可以检测到一些来自肿瘤的物质，包括循环肿瘤细胞 (Circulating Tumor Cell, CTC)、循环肿瘤 DNA (Circulating Tumor DNA, ctDNA)。需要指出的是，游离 DNA 可以来自正常细胞和肿瘤细胞，ctDNA 特指来自肿瘤的游离 DNA。



图1. 血液中的主要物质

DNA 是遗传信息的主要载体，细胞在发生癌变的过程中 DNA 上会发生一系列的变异，因此肿瘤细胞的 DNA 与正常细胞的 DNA 存在诸多差异。这种差异既可以是染色体异常，也可以是基因变异，也可以是 DNA 上的一些化学修饰，比如 DNA 甲基化。



图2. 基于ctDNA和CTC的肿瘤液体活检

ctDNA 甲基化可在肿瘤发生的早期被检测到，而且具有较好的稳定性，因此 ctDNA 甲基化成为肿瘤液体活检中一个极具价值的标志物。
检测信号: 检测ctDNA甲基化的技术手段

ctDNA 甲基化的检测主要可以分为基于重亚硫酸盐转化 (bisulfite conversion-based) 和不依赖于重亚硫酸盐转化 (bisulfite free) 的方法。生物体基因组仅仅由 A、T、C、G 四个碱基构成，当 DNA 被亚硫酸盐处理后，没有甲基化的 C 转变成了 T，而甲基化的 C 不发生改变，因此在后续的检测中可以区分原始位点是否被甲基化。
重亚硫酸盐转化方法又可以细分为全基因的检测，代表性的方法包括 WGBS (whole-genome bisulfite sequencing) 和 RRBS(reduced-representation bisulfite sequencing)。如果要检测特定位点的甲基化，可以用焦磷酸测序、甲基化芯片和甲基化特异性的 PCR(MSP)。



图3. ctDNA甲基化检测方法

  不依赖于重亚硫酸盐转化 (bisulfite free) 的方法又可以分为基于富集的方法 (Enrichment-based) 和基于限制性内切酶 (Restriction enzyme-based) 的方法。ctDNA 检测方法具体详见上图3。
破译信号: ctDNA甲基化数据分析策略

采集到了这些肿瘤特异性的甲基化信号，如何破译其中蕴含的信息，是基于 ctDNA 甲基化的液体活检的关键。人类有两万多个基因，每个基因的甲基化水平在细胞癌变过程中都可能发生改变，鉴定肿瘤特异性的甲基化标志物或者它们的组合，犹如大海捞针。科学家们要做的正是在这汪洋大海中精准地将这根/批针捞上来。
具体而言，数据分析主要包含以下流程：1) 质控和数据比对。即对数据进行质量控制，保留高质量的数据，并将质控后的数据与人类参考基因组进行比对；2) 找寻 DNA 甲基化位点/甲基化峰并进行定量；3) 差异化的 DNA 甲基化分析；4) 鉴定肿瘤特异性的甲基化标志物。甲基化这类生物大数据的计算需要用到多种软件，而且在肿瘤特异性甲基化的鉴定过程中，还需要借助各种深度学习的算法，比如随机森林、LASSO 回归、弹性网络等。



图4. 近期基于ctDNA甲基化的液体活检研究汇总

造福人类: ctDNA甲基化的临床应用场景

当我们找到肿瘤特异性的甲基化标志物后，用这些标志物或它们的组合作为新的工具，来检测肿瘤，并与临床的病理结果对比，以评估这种基于 ctDNA 甲基化的新工具的临床表现。
我们大费周折地检测 ctDNA 甲基化，做了一系列分析，我们真正关心的问题是，ctDNA 甲基化能解决哪些问题。研究已经证实的 ctDNA 甲基化的用途包括：1) 肿瘤检测，包括肿瘤的筛查和早期诊断；2) 分子分型和预后判断；3) 检测微小残留病灶，这对于肿瘤的复发检测至关重要；4）评估治疗效果，尤其是对于免疫治疗而言意义重大。免疫治疗是众多晚期肿瘤患者的救命稻草，但是免疫治疗只对约20%的患者有效，能否在治疗前就分辨出对哪些患者有效，避免80%的晚期肿瘤患者最后“钱也没了，人也没了”；5) 对ctDNA进行组织溯源，即分辨血液中的ctDNA来自哪些组织或器官。



图5. 基于ctDNA甲基化的肿瘤液体活检

总体而言（如上图5所示），ctDNA 甲基化是肿瘤早期或复发早期的重要信号，检测体液中的ctDNA 甲基化对于肿瘤的筛查、早期诊断、预后判断、复发检测、疗效评估等关键难题极具应用价值。

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