免疫荧光染色之抗体挑选全攻略

good

免疫荧光染色技术依赖于抗原抗体相互作用的极高特异性。通过将不影响抗原抗体功能的荧光染料标记在抗体或抗原上，当标记的抗体与其对应的抗原特异性结合时，可在荧光显微镜下观测到一种特异的荧光信号，从而判定抗原的存在、散布和位置。今天，小编将与大家探讨免疫荧光染色中抗体的选择方法，希望能对大家有所帮助。
免疫荧光染色一抗的挑选

①依据样本挑选一抗
一抗的物种来源应尽量避免与检测样本的物种相同，以防止二抗与样本内生的免疫球蛋白发生交叉反应。例如，若检测的是小鼠样本，那么一抗应避免选用小鼠或大鼠来源，而应考虑如兔来源等其他物种的一抗。这样，在选择二抗时便可选用抗兔的二抗，从而规避交叉反应的问题。
②确认抗体检测目标即为研究目标蛋白
在免疫荧光染色或其他抗体相关的实验中，由于同一蛋白可能存在多个不同的名称或同义词，因此，确保所选抗体的检测对象与我们研究的目标蛋白完全一致是极为关键的。为避免因命名混淆而引发的实验误差，一个简单且有效的方法是通过对比UniProt ID来验证抗体的特异性。同时，所选抗体的说明书需明确表明适用于免疫荧光实验，即IF。
如我想对PGC-1α进行标记，我在Abcam搜索PGC1a，找到的结果显示可进行IF染色，便可选择，接着我们需考虑物种来源等其他要求。
③确定抗体的反应物种
在选择一抗时，我们首先要仔细研读抗体的产品说明书。说明书中会清晰列出抗体的反应物种，即该抗体能够识别的物种或类别。我们所选的抗体必须能够识别我们样本的物种。例如，若样本是小鼠组织，那么需选用一种能够识别并结合小鼠组织中小鼠蛋白的一抗。若需进行多种抗体标记，则还需考虑一抗选用不同的物种来源。
④何谓预测可检测的物种？
在抗体选择过程中，有时会在产品说明书上看到“预测可与哪些物种反应”（Predicted to react with）这样的表述。这通常是厂家基于目标蛋白在不同物种间的相似性进行的一种预测，意味着抗体可能能够识别并结合这些预测物种中的相似蛋白。由于这种预测未经实验验证，厂家通常不会为这类抗体的性能提供保证。
免疫荧光染色二抗的挑选
①二抗的物种来源需与一抗相匹配
若一抗是兔来源的，那么应选用识别兔IgG的二抗，即anti-rabbit IgG。
②依据一抗类型与亚类
当一抗是多克隆抗体（多抗），如来源于兔、山羊等，且为IgG同型时，二抗一般选用抗IgG(H+L)的。这是因为多克隆抗体由多个B细胞克隆产生，它们识别的是抗原上的多个表位，且它们的重链和轻链都可能参与抗原的结合。因此，选用抗IgG(H+L)的二抗可确保与一抗的Fc段（包含重链恒定区）以及可能涉及的轻链部分均有良好的结合。
当一抗是单克隆抗体（单抗），来源为小鼠IgG1时，可选用Anti-Mouse IgG1的二抗，这样的二抗仅针对小鼠IgG1的亚类，具有高度的特异性。然而，在某些情况下，为增加实验的灵活性和兼容性，也可选用anti-mouse IgG(H+L)的二抗。这种二抗能够识别小鼠IgG的重链和轻链，因此不仅适用于IgG1亚类，也适用于其他小鼠IgG亚类（如IgG2a、IgG2b等），从而拓宽了其实验应用范围。
③荧光染料的选择
若实验需进行多重检测，即同时检测多个目标，那么需选用光谱不重叠且稳定明亮的荧光染料。这样可确保每个目标都能被独立且清晰地检测到。免疫荧光三标可选用488、555、647。
举例分析
免疫荧光三标选择抗体：
①三种一抗物种来源各异，如分别选用来源于猪、小鼠、兔的。
②三种二抗的物种来源最好是相同的，且不同于任何一种一抗，此处便可选用Goat-anti-pig 488、Goat-anti-mouse-555、Goat-anti-rabbit-647。
其他的选择要求自行判定，免疫荧光多重染色选择抗体可能较为困难，可考虑采用TSA技术。
补充一下：需明确你的研究对象是何种，是细胞表面的蛋白，还是细胞内的信号分子？不同的抗体针对不同的靶标，需选用正确的抗体。

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/19929759837