两个蛋白直接相互作用的检测方法有哪些？

非诚勿扰孟非

噬菌体展示技术，酵母双杂交系统可以检测直接相互作用吗

原文地址：https://www.zhihu.com/question/523221832

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1. 免疫共沉淀法（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）：利用抗体特异性地结合目标蛋白，然后通过沉淀和洗涤等步骤将与其相互作用的蛋白一起提取出来进行检测。

2. 酵母双杂交法（Yeast Two-Hybrid，Y2H）：利用酵母细胞内的转录激活子和DNA结合蛋白的相互作用来检测两个蛋白之间的相互作用。

3. 荧光共振能量转移法（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）：通过将荧光基团标记在两个蛋白上，当它们靠近时会发生能量转移，从而可以检测到它们之间的相互作用。

4. 表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）：利用表面等离子体共振现象来检测两个蛋白之间的相互作用。其中一个蛋白被固定在芯片表面上，另一个蛋白则通过流动注射进入芯片中与其结合。

5. 质谱联用技术（Mass Spectrometry，MS）：通过将两个蛋白混合后进行质谱分析来检测它们之间的相互作用。

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如果想检测直接的相互作用（in vitro）
可以考虑微量热泳动（MST），等热量热滴定（ITC），表面等离子体共振（SPR），原位非变性质谱等方式

队长是我

在正式讲解发表在《Nature Cell Biology》上的28+文章之前：Mitochondrial fission links ECM mechanotransduction to metabolic redox homeostasis and metastatic chemotherapy resistance
老熊先来讲讲PLA技术，以防大家看到结果图时发懵，大家先来思考一下：如何可视化蛋白质相互作用？我们比较熟悉的验证蛋白相互作用的手段包括酵母双杂交、CO-IP等等。文章里用到的方法是PLA技术，这是一个比较新的技术，PLA技术全称为Proximity Ligation Assay，译为邻位连接或者邻近连接技术，它结合了 ELISA 的特异性和 PCR 的灵敏度。
原理
这个技术使用了一对 DNA 邻位探针，每个探针都由Ab–Oligo组成：高亲和力寡核苷酸+特异性抗体，也就是PLA probe（探针）。如果两个蛋白有相互作用，就会使两个探针之间距离缩短，产生了所谓的邻近效应（proximity），此时加入一段分别与连接在抗体上的DNA互补的寡聚脱氧核苷酸作为连接子（connector oligonucleotides），PLA probe上的DNA就会通过配对互补作用，与该段DNA互补。接着在连接酶的作用下，形成环状单链DNA分子，并通过滚环复制产生多连体。然后用荧光探针进行PCR扩增，从而对这个新的DNA片段进行定量。



Alam MS. Proximity Ligation Assay (PLA). Curr Protoc Immunol. 2018;123(1):e58.

回到这篇文章上来，在这个实验中，他们的一抗分别是单独抗两个蛋白的抗体，即anti-NRF2和anti-KEAP1，而二抗是分别抗一抗种属的抗体偶联DNA单链制成的二抗探针，这样加入二抗探针后，如果两个蛋白存在相互作用，每对探针的DNA单链会紧密相邻，在连接酶的作用下带荧光标记的DNA短序列通过滚环复制形成多连体，就会荧光显微镜下看到相应的荧光（类似下面这张示意图）。


所以他们得到的结果图是：


这个结果说明了用MLCK 抑制剂YM处理后， MCF10A-RAS细胞内源性NRF2和Keap1的相互作用减弱（特异性的红色荧光点）。这里作者每次用一种一抗作为本底：抗NRF2或抗Keap1。白色虚线表示细胞轮廓，以敲除Keap1和NRF2(分别为siKEAP1和siNRF2)作为特异性对照。
知识拓展之蛋白相互作用检测手段：
（1）免疫共沉淀(Co-IP)是识别蛋白质-蛋白质相互作用的金标准，用针对其中一种蛋白质的抗体来免疫沉淀该蛋白质，顺便把与该蛋白有相互作用的蛋白也一起沉淀了下来，然后用WB进行检测。但是Co-IP需要大量靶蛋白，而且不适用复杂的蛋白作用比如有些蛋白并不一定直接相互作用。
（2）串联亲和纯化(TAP)：这个之前我们也讲过，这个是对靶蛋白质结合的蛋白进行高通量筛选。这个方法需要对靶蛋白进行表位标记并对复合体进行亲和纯化，然后打质谱(MS)。但是这种蛋白纯化程序可能给出假阳性的非特异性蛋白质，而且标签还可能会干扰蛋白质之间的相互作用，导致无法检测到瞬时相互作用。
（3）酵母双杂交我们也比较熟悉了，是根据转录活性检测相互作用的蛋白质。在酵母中，如果两种蛋白质存在相互作用，能启动报告基因的转录。这种方法也容易出现假阳性，筛出来的蛋白可能在生理条件下并不会存在相互作用。
（4）FRET(荧光共振能量转移)是比较新的技术，分析两种荧光标记的蛋白质之间的相互作用，比如青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)非常接近(<10 nm)时，光激发的CFP吸收的能量转移到YFP，YFP然后发射更高波长的光。FRET的局限性主要体现在成像时信噪比低，而且荧光蛋白对局部环境的变化很敏感，如pH、离子浓度、氧化和温度。
（3）原位PLA也是一种比较新的方法来检测细胞或组织中蛋白质的相互作用，理论上只要有合适的抗体，就都能检测。因为这个方法是通过DNA进行检测，能放大相互作用信号，高度敏感。但Duolink PLA不能用于活细胞，因为抗体和探针需要渗透才能找到target。而且一些PLA试剂如酶或DNA寡核苷酸可能破坏细胞的活性。

好了，就讲这么多，这篇28+的文献精读指路：
Nat Cell Biol (IF=28+)| 新靶点——转移性化疗耐药：线粒体分裂充当胞外基质信号转导与氧化还原稳态桥梁
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检验医师

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清风寡欲

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