生信分析——流式细胞术

会里很

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒（如微球、细菌、小型模式生物等）逐个进行快速定量分析和分选的技术，被广泛的运用于从基础研究到临床实践的各个方面，涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中发挥着重要的作用。


如上图所示：细胞悬液在通过流式细胞仪时，一次仅可通过一个细胞，那么机器是怎么分辨不同细胞的呢？这也是我们理解流式细胞图的关键。
在此之前，我们先来了解一个概念：流式通道。
流式通道主要可以分为散射光通道和荧光通道：散射光通道有两个，包括FSC通道和SSC通道，而不同型号的流式细胞仪其荧光通道的多少差异较大，有的甚至没有荧光通道。
1.散射光通道
FSC，即前向角散射，它的值代表细胞的大小。细胞体积越大，其FSC值就越大。所以可以利用细胞的FSC值初步比较细胞的大小，利用FSC值对细胞进行分群和分类。
SSC，即侧向角散射，它的值代表细胞的颗粒度（与细胞中所含的细胞器、细胞核等的数量成正比）。细胞越不规则，细胞表面的突起越多，细胞内能够引起激光散射的细胞器或者颗粒性物质越多，其SSC值就越大。所以可以利用细胞的SSC值初步比较细胞的颗粒度，利用SSC值对细胞进行分群和分类。
当细胞通过激光束时，检测器会检测到细胞或颗粒的散射光，放置在前面的检测器检测FSC，而放置在侧面的多个检测器检测SSC。这样我们得到的就是细胞的物理特征，根据其物理特征进行分群分类。

2.荧光通道
荧光通道表示的不是细胞特有的物理特征，而是其化学特征。如需要检测样品中是否有细胞表达某一CD分子，就将这一CD分子的抗体与特定的荧光素偶联，这种荧光素通过荧光通道时会被激发而产生荧光。这样该抗体与被检细胞结合后，就可以被识别到，我们也就能得到就能得到该样品中是否有细胞表达该CD分子（即区分阳性细胞和阴性细胞），以及有多少比例的细胞表达该CD分子等信息。


荧光通道接收到的信号越强，表示细胞上结合的荧光素越多，那么细胞表面表达的该CD分子就越多，因此可根据荧光信号的强弱判断细胞表达该CD分子的相对数量。总之，荧光通道值反映接收到的荧光信号的强弱，从而反映细胞上结合的荧光素的量，进一步反映细胞上表达该CD分子的量，最后间接反映细胞表达某CD分子这一化学特征。
了解了这个概念后，我们就可以很容易的看懂流式细胞图在表达什么。

流式图最常用的是流式直方图和流式散点图，还有一种流式等高线图。流式直方图只能显示一个通道的信息，流式散点图和流式等高线图可以同时显示2个通道的信息。
1.流式直方图
流式直方图是在统计学直方图的基础上进一步发展而成的。我们可以简单的理解为曲线上该点对应的y轴值就是x轴代表的通道的荧光信号值对应的细胞数。


图（1）中100～101（M1）为阴性细胞，101以上的（M2）为阳性细胞；图（2）中2N代表G0/G1期细胞，4N代表G2/M期细胞，两者中间代表S期细胞。

值得注意的是，不同细胞群的FSC值和SSC值最多相差几倍，而荧光信号强弱之间一般相差很大，阴性细胞与阳性细胞之间、强阳性与弱阳性之间有时可以相差几十倍、几百倍，甚至几千倍，呈指数关系。所以，流式图数轴上FSC值和SSC值以“一般数序形式”表示，而荧光通道值常以“对数形式”（logarithmic scale）表示，在识图时需要注意数轴的表示形式。当然，并不是所有的荧光通道值都以“对数形式”表示，当荧光信号值相差不多时，也可以“一般数序形式”表示。
2.流式散点图
流式散点图能够同时表示两个通道的信息，更加直观和常用，x轴表示一个通道的值，y轴表示另一个通道的值，图中每一点代表一个细胞，该点所对应的横坐标值就是该点所代表细胞的x轴通道的值，所对应的纵坐标值就是该点所代表细胞的y轴通道的值。


如图表示的是某正常人外周血白细胞FSC－SSC散点图。FSC代表细胞的大小，SSC代表细胞的颗粒度，从图中可以看出，根据细胞的大小和颗粒度，正常人外周血白细胞可以分为3群。小细胞、小颗粒度的红色细胞群是淋巴细胞群，T细胞、B细胞和NK细胞都位于此淋巴细胞群；中细胞、中颗粒度的绿色细胞群是单核细胞群；大细胞、大颗粒度的黄色细胞群是中性粒细胞群。

一般在流式分析过程中，先利用FSC-SSC物理图根据细胞的大小和颗粒度将细胞进行分群，然后根据目标细胞处于哪个群体，再将该群体细胞设门（set gate），进一步分析该群体中的目标细胞。
门（gate）是流式分析过程中一个较为重要的概念，流式分析时有时不希望所有的样品细胞都显示于流式图中，而是希望只显示感兴趣的细胞，排除其他非相关细胞的干扰，使显示的信息更加直观，更具有针对性。例如，分析CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞的比例时，此时可以根据CD4的表达情况，将CD4+T细胞设门显示于一个新的流式图中，则该流式图只显示所设门内的细胞，即只显示CD4+T细胞，其他无关细胞不会被显示。在相应散点图中x轴代表CD4信息，y轴代表CD25信息，这样就可以非常直观地计算出调节性T细胞的比例。说白了就是框定一个区域的细胞，让计算机分析该区域各类细胞的比例。

3.流式等高线图
流式等高线图与流式散点图相似，一张流式等高线图也能同时显示两个通道的信息，所不同的是，流式等高线图借助地理等高线图表示细胞的密集程度，流式等高线图的环线代表的是细胞密度相同的区域，所以，等高线越密集的地方表示此区域细胞密度变化越快，环线的中央区域代表细胞聚集的中心。


流式等高线图的意义和实际应用与流式散点图较为相似，可以看作是流式散点图的一个变体。相比之下，流式散点图更为直观，所以应用也更为广泛。当然，流式等高线图也有其自身的优点，它较能直观地体现细胞群的集中点，等密度环线的中央区域代表一个细胞群的集中点，一般代表一个细胞群，所以在某些情况下，流式等高线图比流式散点图更能直观地体现细胞的分群。

原文转载自：医学僧的科研日记（ID：zzudoctor）

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