个人Western Blot经验分享

非诚勿扰孟非

蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot，是一种常用实验手段，本人对实验前期经验进行总结，希望对各位科研人员有所帮助和借鉴。
<hr/>01相关试剂配置
电泳液：Tris 3.03g 、甘氨酸  18.8g 、 SDS  1g
转膜液：Tris 3.03g 、甘氨酸  14.4g 、 ddH2O  800ml 、 甲醇  200ml
TBST(10×)：Tris  12.1g 、NaCl  40g 、ddH2O 500ml
<hr/>02实验步骤
① 配胶（以雅酶配胶盒为例）
(推荐:7.5%胶：分子量 30以上；10%胶：分子量20~150；12.5%胶：分子量50以下)
取玻璃板，长短各一。检查玻璃板是否干净，可用擦镜纸对玻璃板进行清洁。将两玻璃板贴在一起（注：字在上），插入夹内，用大拇指轻推玻璃板，敲一敲桌面，使玻璃杯底部对齐夹紧玻璃板。将塑料垫放于架子上，放上制胶架上。（注：第一次操作可用水检测是否漏水，否即可将水倒出，用吸水纸吸干水，进行下一步操作。如出现泄露，需检查，从新调整，保证不漏水的情况下方可进行下一步）
下层胶：AB液：1：1配置（1.0玻璃板两板：5ml：5ml）；促凝剂：100ul；压胶液（异丙醇/无水乙醇）：1ml；时间：15分钟以上。（倒出，用去离子水冲洗，滤纸吸干）
上层胶：AB液：1：1配置（1.0玻璃板两板：2ml：2ml）；促凝剂：40ul；灌入后，根据样本数量不同选择不同梳子类型（推荐：15口梳子，内参更易齐哦！！！）；时间：30分钟以上
② 电泳
将制好的胶板取出，安装于电泳槽上（注：小玻璃板在内侧，如只制作一板胶，则需将假板放于一侧，防止电泳液泄露）。将电泳槽放于电泳盒中，双手分别捏住梳子轻轻拔出，检查胶口是否被胶堵住，如果正常便向电泳槽加电泳液至溢出为止。根据样本数量，吸取3ul marker于胶板口（建议样本两侧都加3ul，防止边缘效应），并依次加入适量上样液（注：上样时需缓慢注入，样本第一次上样推荐10ul，副口，方便后期调整内参）。然后向电泳槽中加入适量电泳液。电压120V，所需时间需预实验尝试确定（如果配置本文电泳液，推荐60min），至marker分出所需位置marker后即可停止。
③转膜（湿转为例）
根据实际情况剪取适合大小的PVDF膜（推荐：4cm宽，长：15口一口0.5cm，10口一口1cm）。（注：需剪去一角确定方向）；取适合大小的水槽，倒入适当的转膜液，将转膜夹（黑板—海绵—厚滤纸，厚滤纸—海绵——透明板）浸入转膜液中，随后取出。将玻璃板在梳子口这侧撬开，切到适合大小。将厚滤纸（黑板侧）盖在胶上，翻转。小心将胶转到厚滤纸上，将厚滤纸放于海绵（黑板侧）上，调整胶块，使marker与厚滤纸底边垂直。随后在胶上确定加样方向，后期将PVDF膜一角在加第一样侧，方便后期显影确定加样顺序。将PVDF膜浸入甲醇中1min左右，将PVDF膜放于胶上适合位置（用marker条带确定）。剪掉一角边在加第一样侧，盖在胶上，用滚轮排出气泡，盖上另一侧滤纸，海绵，透明板。将转膜板放于转膜槽内，黑板对黑边。倒入转膜液，放入冰袋。电流200mA，时间需预实验确定（推荐：75分子量以下120min，75分子量以上180min）。 （推荐：后面每步之间均需要TBST清洗，5min，4次）
④ 封闭
转膜结束后，将整块PVDF膜放入孵育盒，TBST洗5min，倒入封闭液（根据封闭液不同，条带背景不同，封闭不同时间）。

⑤ 切膜
将洗好的膜放在塑料薄膜上，盖上塑料薄膜，防止切割时损坏条带。建议两marker间选择做一个目的蛋白，否在可能出现切掉的情况。如果第一次做建议宽一些，使两marker在膜上即可。（这步TBST洗一次即可）
⑥ 一抗
加入适当的一抗稀释液，4℃过夜/室温2小时，可回收。
(如果蛋白表达高，建议4℃过夜，效果最好；如果蛋白表达量低，建议室温两小时)
⑦ 二抗
加入适当的二抗稀释液，室温2小时随后显影即可！！！
<hr/>03 相关问题解答
① 背景深？
如果是第一次做，一抗二抗均是新的，内参背景正常，那么就是一抗问题。
解决方法：①4℃封闭过夜；②换封闭液； ③换一抗
如果是第一次背景正常，突然背景深了，建议一抗，二抗，封闭液同时配新的。最快解决问题，不要浪费时间！！！
② 条带不出？
说明书建议分子量一般没问题，那么要不就是表达量低，要不就是一抗不行，最不可能的就是二抗错了，那就有点傻了！！！
解决方法：①降低一抗稀释比，如原1：1000改为1：200； ②提供样本蛋白浓； ③换一家试剂商的一抗   
以上三种都不行，别挣扎了，就是没有了！！！
③ 内参齐？
建议在一块胶板上一个样本做两次。解决方法：加样顺序如下，每口10ul
marker、A、B、C、marker、A、B、C、marker
显影后，算各口灰度值，取各样本所对最大值。以灰度值最低的样本定为最大上样量10ul。假设是C样本灰度值是最低，那么A或B加样量=10ul×C灰度值/A或B灰度值。

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