怎么让免疫荧光多标染色更“靓”？看看这个神器！

幸福侠侣

随着研究的深入和细化，多标染色技术应用越来越广泛，越来越多的科研论文中出现相关数据，之所以现在多标染色技术受到众多科学家的青睐，这是因为其相较于单色荧光，多标染色能够在同一样本玻片上实现不同靶标共定位和共表达情况、丰度检测以及细胞表型/异质性分析等复杂数据的展示。不过最近也有很多小伙伴在向小P反映做免疫荧光多标染色的时候遇到了一些问题：
比如找不到合适的商业化荧光直标抗体；比如通过间接法做多标染色难度很大；比如用TSA方法做多标染色操作又很繁琐；再比如用其他抗体标记试剂盒的时候对抗体要求很高，且标记好的抗体有损耗。往往在这个时候小P就会向小伙伴推荐我们Proteintech的重磅黑科技产品，也是全球独创的FlexAble抗体标记试剂盒，通过这款产品小伙伴们只需要10分钟，即可轻松完成一抗的荧光标记。


FlexAble是Proteintech研发的一种新型抗体标记试剂盒，该试剂盒采用FlexLinker抗体标记技术专利，可在任何抗体缓冲液条件下，快速将荧光染料、酶以及其他分子与抗体结合，极大提高流式细胞术、免疫荧光及免疫印迹实验效率。这款产品一经发布，迅速赢得了众多小伙伴的好评和点赞，甚至有些小伙伴还使用FlexAble抗体标记试剂盒发表了很多不错的文章（优秀案例详见本期次条文章）。
FlexAble精彩文献集锦


不过小P也收到了一些小伙伴的反馈，说我们这个产品在做一些表达丰度相对较低的靶标的荧光染色时，其荧光强度稍微有点弱。（非常感谢小伙伴们的建议，小P都牢牢的记在了心里 wink~）
所以这次我们重新升级了FlexAble抗体标记试剂盒，然后重磅推出了FlexAble 2.0 抗体标记试剂盒新产品！




FlexAble 2.0在保留1.0产品优势的基础上，我们创新性的对其荧光染料做了新升级。
首先是对染料质量进行了升级，这次2.0的产品我们将 Flexlinker上的荧光染料全部替换成了CoraLite® Plus系列，这个系列是我们Proteintech自主研发、生产的专利荧光染料，其相比于传统染料具有更高的荧光强度且光稳定性也更好。
然后是对染料数量进行了升级，我们在1.0产品的基础上，对2.0产品Flexlinker上荧光染料的数量进行了新升级，使其荧光强度相较于1.0产品提升了数倍。
从整体上看，这次FlexAble 2.0相较于1.0版本有了不错的提升，使2.0产品能够更加从容的应对免疫荧光多标染色。
同时也有小伙伴向我们反馈使用FlexAble 1.0产品时没有详细的说明书，导致实际使用过程中遇到一些小细节不知如何操作，所以本次FlexAble产品升级的同时，我们也一起发布了FlexAble抗体标记试剂盒详细的中文说明书和常见问题解析，方便小伙伴们了解和使用我们的产品。

下面小P就给大家展示一下使用FlexAble 做的一些非常酷炫的结果吧~



小鼠结肠组织的免疫荧光分析：黄色，一抗，CD45重组兔单抗（80297-1-RR），二抗，CL555偶联羊抗兔二抗（RGAR003）；洋红色，一抗，CDH1兔多抗（20874-1-AP），FlexAble抗体标记试剂盒（KFA003）；绿色，一抗，HNRNPA3兔多抗（25142-1-AP），FlexAble抗体标记试剂盒（KFA001）红，直标一抗（CL594-14395



小鼠结肠组织的免疫荧光分析：黄色，KFA522标记α-SMA抗体；洋红色，KFA503标记FUS抗体；绿色，KFA504标记E-cadherin抗体；蓝色，DAPI



Hela细胞的免疫荧光分析：绿色，CoraLite® Plus 488-conjugated TDP-43；红色，CoraLite®555-conjugated GOLGA；洋红色，KFA503标记Lamin B1抗体；青色，KFA504标记Beta Tubulin抗体；蓝色，DAPI



大鼠脑组织的免疫荧光分析：绿色，KFA503 标记GFAP抗体；黄色，KFA541标记TDP-43抗体；洋红色，KFA542标记MAP2抗体；蓝色，DAPI

并且使用FlexAble标记好的抗体也能用于流式实验分析哦，效果也是非常不错的！



人PBMCs流式细胞实验分析：KFA564标记人CD4 (Clone:OKT4)，KFA521标记人CD3 (Clone: UCHT1)  



人PBMCs流式细胞实验分析：KFA522试剂盒标记人CD4 (Clone:RPA-T4)，CoraLite® Plus 647 Anti-Human CD3 ( Clone:UCHT1)

那么FlexAble 1.0和2.0小伙伴该如何选择呢（敲黑板，重点来啦）


小P建议：在多重染色中，FlexAble 1.0适合高丰度蛋白抗体标记，FlexAble 2.0更适合中低丰度蛋白抗体标记；流式抗体的标记，二者均可。
看了这么多非常酷炫的图，想必大家对FlexAble 2.0抗体标记试剂盒已经有了初步的认识了，那好奇的小伙伴可能就会问了，这FlexAble抗体标记试剂盒到底该怎么用呢？其实步骤挺简单的，接下来小P就以细胞爬片的FlexAble染色操作流程为例进行举例说明。


1. 细胞固定及通透
1) 吸走培养基，用1×PBS缓冲液缓慢清洗种上细胞的细胞爬片。
2) 室温条件下，用4% PFA固定15 min或者使用-20℃甲醇或乙醇固定10 min。
3) 固定结束后，用1×PBS缓冲液清洗细胞爬片三次，3 min/次。
4) 室温条件下，用0.2% Triton X-100-PBS溶液将细胞通透处理5 min。细胞通透结束后，用1×PBS缓冲液清洗细胞爬片三次，3 min/次。
（注：如果使用的固定剂是有机溶剂，此步骤可免）
2. 封闭
将样片置于干燥的培养皿内，滴加3% BSA-PBST（0.1% Tween）；将样片完全覆没放于湿盒中，室温封闭1 h或者4℃封闭过夜。
3. 标记抗体制备
1) 将0.5 μg的一抗与1 μL FlexLinker混合后加入FlexBuffer补充体积至8 μL，轻轻混匀，室温避光孵育5 min。
（注：请参考《FlexAble抗体标记试剂盒常见问题解析》-标记抗体量及浓度说明）
2) 加入2 μL FlexQuencher，混匀后，室温避光孵育5 min。
3) 使用PBS补充体积至50-100 μL。
4. 抗体孵育
1) 用吸水纸将多余封闭液吸去，注意不要干片。
2) 在样片上滴加一种FlexAble标记抗体（一抗+FlexLinker+FlexQuencher混合物）或多种FlexAble标记抗体混合物（将所有标记抗体混合在一起，进行多重染色），室温避光孵育2 h或4℃避光孵育过夜。设置不加一抗的空白对照。
3) 用PBST（0.1% Tween）溶液清洗样片，洗涤3次，每次5 min。
4) 在样片上滴加DAPI，将完全浸没于DAPI的样片放于湿盒中室温避光孵育5-10 min。
5) 用PBS缓冲液清洗样片，快速冲洗3次。
6) 滴加封片剂，确定样品在盖玻片与载玻片之间，避免出现气泡。
7) 用荧光显微镜观察。根据不同的染料选择不同波段的激发光。
（组织切片的实验操作步骤以及其他注意问题可以参考FlexAble 2.0中文说明书）

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