干货分享！小鼠骨髓细胞染色体样本制备实验

生物科研实验室

一、实验原理小鼠骨髓细胞中的有丝分裂活动旺盛，因此能够直接获取中期细胞，无需像血淋巴细胞那样需经过体外培育。骨髓细胞具备高度的分裂能力，经过秋水仙碱（秋水仙素）处理后，能将分裂的细胞阻滞在有丝分裂的中期阶段。随后，通过低渗处置、固着、滴涂、着色等一系列步骤，可以制作出优质的骨髓细胞染色体样本。
利用骨髓获取染色体相对简便，通常无需在无菌条件下操作。此方法在临床医学中多用于白血病的研究，在实验环境下，这种染色体能够真实反映机体内的状况，而且采用骨髓制片的方式便于观测毒性物质在体内对细胞和染色体的作用。
二、实验流程与操作指南1、秋水仙碱处理：在提取骨髓前的3-4小时，先向小白鼠腹腔注射0.1%的秋水仙碱，注射量为每公斤动物体重4毫克。
2、骨髓提取：将经过秋水仙碱处理的小白鼠采用损伤脊髓法（如断颈法）快速处死，随后使用剪刀剪开大腿的皮肤和肌肉，取出股骨和胫骨，用一小块纱布反复擦拭以清除骨头上的肌肉和碎屑。剪去股骨两端的关节头，将股骨剪碎后放入小烧杯中，加入2毫升1%的柠檬酸钠溶液，搅拌使骨髓细胞游离出来。静置片刻后，用吸管将悬浮液吸入离心管中，可重复冲洗一次，此时离心管中的细胞悬浮液量可达4-5毫升。
3、低渗处理：将所得的细胞悬浮液进行平衡（注意：每次离心前均需进行平衡），然后以1000转/分钟的速度离心10分钟，吸去上清液，留下0.2毫升沉淀物。加入0.075M的氯化钾溶液至8毫升刻度，将细胞沉淀物吹散并混合均匀，在37℃的水浴中进行低渗处理20-30分钟。
4、固着处理：对低渗处理后的材料以1000转/分钟的速度离心10分钟，吸去上清液，留下0.2毫升沉淀物。用吸管吹散沉淀物，沿管壁加入固定液至6毫升，混合均匀后静置固定20分钟，此为第一次固定。按上述条件离心后去上清液，再次加入固定液至6毫升进行第二次固定。20分钟后离心吸去上清液，留下0.2毫升沉淀物，再向沉淀物中滴加4滴固定液，混合均匀后制成细胞悬液。
5、滴涂制片：取出事先在冰箱中预冷的载玻片（载玻片需经硫酸洗液浸泡10天以上，再用清水冲洗，最后用蒸馏水浸泡），在粘有冰水的载玻片上滴加2-3滴细胞悬液，用嘴吹气使细胞迅速分散。将载玻片插入切片架上晾干。
6、着色处理：取2张制片平放在玻璃板上，用10:1的Giemsa染液染色20分钟，用流水冲洗后晾干即可进行镜检（也可使用苯酚品红溶液进行染色）。
7、观察分析：使用中倍镜挑选分散适度、无重叠的染色体分裂相，转换至高倍镜详细观察小白鼠染色体的形态特点，并计算2n的染色体数量。
三、细胞观察标准1、细胞完整无损，轮廓清楚，染色体分布在同一平面上。
2、染色体形态和分布状况良好。
3、尽量避免重叠，即使有个别重叠现象，也要能够清晰辨认，以防出现错误。
4、所观测的细胞应处于相同的有丝分裂阶段，即染色体的螺旋化程度或染色体长度大致相同。
5、在所观测的细胞周围，不应存在离散的单个或多个染色体，以免影响计数结果。
四、注意事项1.秋水仙碱的注射时间需提前3-4小时，时间过长或过短均会影响染色体中期的数量和形态。
2.在低渗处理过程中，时间和吹打操作均至关重要。低渗过度会导至染色体膨胀、染色后显得肥胖；而低渗时间不足则会使染色体染色后颜色过深，无法清晰观察条带。