实验技术干货！细胞爬片制备技巧及步骤

生物科研实验室

一、载玻片的预处理1，爬片可采用常规盖玻片或特定爬片。
2.把裁剪适宜的爬片，放入浓硫酸中浸泡一整夜，次日先以自来水清洗20次，再以三次蒸馏水清洗3次，置于餐盒或培养皿中干燥后，进行高压灭菌处理，再次干燥。
4.以多聚赖氨酸对玻片进行处理，增强细胞与玻片的附着性。
二、细胞爬片的制备过程1.利用胰酶对细胞进行消化后，进行计数，并将细胞重新悬浮于全培养基中。
2.在添加细胞时，依据玻片尺寸，预先在各孔预定放置爬片的位置滴加少量培养基，以利用培养基的表面张力使玻片与培养皿紧密贴合，然后放置玻片，避免加入细胞悬液时玻片浮动，导至细胞双层贴附。整个流程需确保无菌操作。
3.根据实验需求，选定适当的细胞密度接种于培养板中。
4.待细胞贴附于壁面后，去除上清液，加入含有药物的培养基。
5.依据实验规划，经过一定时间后取出玻片。由于玻片与培养皿底部结合紧密，张力大，我通常采用将注射器针头尖端弯曲成小钩，轻轻挑起爬片，再用小镊子取出。取出所需数量的爬片时，需用酒精灯火焰对针头和镊子进行消毒。
三、细胞爬片的固定处理1.取出细胞爬片后，通常以PBS清洗2次，然后进行固定。
2.在室温下固定15分钟后，弃去固定液，以PBS清洗3次，每次3分钟，确保清洗彻底。
3.将玻片表面液体吹干，置于-20℃环境中保存。
四、常见的爬片固定剂(1)多聚甲醛(常用浓度为4%):适用于免疫荧光及TUNEL染色。主要用于检测组织内较为脆弱的抗原，尤其是细胞表面抗原，室温固定15分钟后，吹干表面液体，于-20℃保存。
(2)甲醛(福尔马林)应用最为广泛，缺点:长时间放置的甲醛可氧化为甲酸，导至溶液pH值下降，影响染色效果；其形成的分子间交联网络可能部分或完全遮蔽某些抗原表位，使其无法充分暴露，可能导至假阴性染色结果。
(3)冷丙酮适用于一般的免疫组织化学染色。
(4)95%乙醇，可用于免疫组化染色。优点:渗透力强，抗原保存较好。缺点:但对低分子量蛋白质、多肽及胞质内蛋白质的保存效果较差，易引起蛋白质变性，固定后可再溶解；染色过程中，若孵育时间过长，抗原可能流失，导至反应强度减弱。