流式细胞术3种常见死细胞排除方法

空白派

流式细胞术的样本主要分为三类：培养的细胞系、液体组织（如血液和骨髓）以及实体组织。液体组织通常通过密度梯度离心或红细胞裂解法分离淋巴细胞或单核细胞；实体组织则需经过组织解剖、酶消化和机械解离等步骤，将目标细胞从细胞外基质中分离出来。在制备单细胞悬液时，任何操作不当都可能破坏细胞完整性，导致死细胞产生。死细胞会与抗体非特异性结合，增加背景染色，影响检测灵敏度，降低实验数据质量。
本文将介绍几种常用的死细胞排除方法，以提高流式细胞实验的准确性和可靠性。



操作流程



操作流程

一、光散色法
在流式细胞术的二维散点图中，死细胞通常表现出低前向散射（FSC）和高侧向散射（SSC）的特征。通过分析前向散射和侧向散射的差异，可以初步区分死细胞和活细胞。
优点：这种方法不需要额外的染色步骤，即可有效排除大部分死细胞，特别适用于流式细胞分选或初步去除死细胞。
注意事项：仅依赖光散射特性来选择活细胞，在某些情况下可能不够准确，因为不进行质膜完整性的测试可能导致对细胞亚群的错误判断。因此，为了提高准确性，建议结合其他方法如荧光染料标记来进一步确认细胞的活力状态。



光散色法

二、染料排除法——核酸染料法
细胞膜的完整性是区分活细胞和死细胞的关键特征之一。死细胞由于膜完整性丧失，膜的渗透性增加，使得核酸染料如碘化丙啶（PI）、7-氨基放线菌素D（7-AAD）和DAPI能够穿透细胞膜和核膜，与DNA结合。
优点：这些染料操作简便，染色速度快，通常在加入染料后即可直接进行流式细胞检测，无需额外的染色步骤。
使用注意事项：
1. 核酸染料具有一定的毒性，长时间染色可能导致活细胞也着色，因此建议在染色后5分钟内进行检测。
2. 可用的核酸染料种类有限，且可选择的检测通道较少。
3. 核酸染料与DNA是非共价结合，染色后清洗会导致染料泄漏，从而降低荧光信号强度，因此染色后不应清洗细胞。
4. 对细胞进行固定或透膜处理会增加膜的渗透性，使染料进入所有细胞，因此核酸染料不适用于需要检测胞内蛋白质的流式细胞实验。



结果图

三、染料排除法——胺活性染料法
胺活性染料，也称为可固定死细胞染料，特别适用于需要检测胞内蛋白质的流式细胞实验。这些染料能够穿透受损的细胞膜，并与细胞质中的胺基反应，形成稳定的荧光产物保留在细胞内。虽然活细胞表面的胺基也会与染料反应，但由于数量较少，产生的荧光信号较弱。染色后，细胞可以进行固定或透膜处理，而死细胞和活细胞之间的染色差异会得以保留。
优点：胺活性染料适合需要固定和透膜处理的胞内蛋白质检测。与核酸染料相比，胺活性染料具有多种激发和发射波长，几乎覆盖所有流式细胞仪的检测通道，非常适合多色流式分析。
注意事项：
1. 在使用前应进行染料浓度滴定，以避免非特异性染色。
2. 增加染色时间和温度不会提高胺活性染料的染色强度。
3. 残留的胺活性染料可能会与抗原竞争抗体结合位点，从而降低抗体的特异性荧光强度并增加背景染色。因此，在用胺活性染料染色后，必须彻底清洗细胞，然后再进行后续的抗体染色步骤。



胺活性染料法

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