Western blot 超全攻略—步骤详解与经验交流（一）

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一. 什么是 Western blot?
Western Blot（WB），即蛋白免疫印迹，是将印迹技术与抗原-抗体反应的特异性相结合的检测技术，用于分离和检测细胞或组织中某一特定蛋白的表达情况。其基本原理是将细胞或组织样本通过电泳分离后，利用印迹技术从凝胶转移到固相介质——NC膜（硝酸纤维素薄膜）或PVDF（聚偏二氟乙烯膜）膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原（目的蛋白）的技术。
二. Western blot 步骤详解
1 总蛋白提取
1.1 细胞总蛋白提取
1）配置蛋白裂解液：蛋白裂解液由RIPA、PI和PPI组成，其中PI和PPI与RIPA的比例均为1：100。
2）细胞准备：倒掉细胞培养皿中的培养基，加入 4℃ 预冷的PBS洗3次，之后尽量吸干净PBS，将培养皿置于冰上。
3）蛋白裂解：向培养皿中加入一定量的蛋白裂解液（依据细胞量的多少来决定），然后用刮刀将细胞刮下来，将细胞转移至1.5mL离心管中，冰上静置30min，期间旋涡振荡2-3次以充分裂解细胞。
4）离心收集：将离心管置于预冷的4℃ 离心机中，12000rpm离心10min，将离心后的上清液转移到新的1.5mL离心管中（也可分装到0.5mL离心管中，避免使用时反复冻融），置于－20℃保存。
1.2 组织总蛋白提取
1）配置蛋白裂解液：蛋白裂解液由RIPA、PI和PPI组成，其中PI和PPI与RIPA的比例均为1：100。
2）组织准备：将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
3）蛋白裂解：加400 μL蛋白裂解液于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。数分钟后再研磨一会儿并置于冰上，要多次研磨使组织尽量碾碎。
4）离心收集：裂解30 min后，用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，将离心管置于预冷的4℃ 离心机中，12000rpm离心10min，将离心后的上清液转移到新的1.5mL离心管中（也可分装到0.5mL离心管中，避免使用时反复冻融），置于－20℃保存。
【注：不同公司裂解液可能有不同的使用方法，具体步骤请参考试剂盒的说明书】
2 蛋白定量
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。我们使用的是PierceTM BCA Protein Assay Kit（Thermo Fisher）试剂盒对所提蛋白进行定量。
1）制备蛋白标准品和待检测蛋白样品：按照所用试剂盒说明书将蛋白标准品进行稀释，最终得到不同浓度梯度的蛋白标准品。
标准品梯度：2000，1500，1000，750，500，250，125，25和0ng/μL
2）稀释目的蛋白：取2.5uL蛋白样品稀释至25μL（适量取样，稀释10倍）。
3）上样：取96孔板，分别加20μL的标准蛋白样品（按浓度梯度）和目的蛋白到孔中。每个目的蛋白样品两个副孔。
4）配制显影液（现配现用）：将A液和B液按50:1的比例混合，每个孔加入200uL的显影液。
5）孵育：将加好样的96孔板放置在37℃ 孵箱中，反应30min。
6）测定吸光度：酶标仪检测562nm波长处的吸光度。
7）计算待测蛋白浓度：以标准蛋白浓度为纵坐标，以562nm波长测定的吸光度为横坐标绘制标准曲线。以标准曲线的得到的计算公式以及测定目的蛋白吸光度为依据，计算目的蛋白的浓度。
8）变性：向蛋白样品中加入loading buffer，将离心管置于金属浴，100℃ 变性10min，变性后的蛋白质用于WB，或-20℃ 保存。
3 免疫印迹
3.1 配置蛋白电泳胶
1）将制胶玻璃板（1或1.5mm）清洗吹干后，固定在制胶装置上。
2）配制10%的分离胶，5mL体系如下：


【注：分子量越大，胶浓度越小，可依据需要配制其他浓度分离胶】
将配置好的分离胶加入玻璃板之间，加入过程要缓慢进行避免产生气泡。然后加入适量的无水乙醇压平分离胶液面。室温放置20-30 min直至分离胶凝固。
3）配制5%的浓缩胶，3mL体系如下：


待分离胶凝固之后，倒掉上层的无水乙醇，加满浓缩胶，慢慢插入与玻璃板匹配的胶梳（注意不要有气泡）。室温静置20-30min等待浓缩胶凝固。
3.2 电泳
1）配制电泳液：称取60.5g的Tris、375g的甘氨酸和20 g的十二烷基硫酸钠（SDS），加水定容到2 L，加热60℃搅拌溶解配制成10×电泳液，室温备用，使用时稀释至1×。
2）电泳装置准备：将含有胶的玻璃板从制胶装置上取下，在水流中匀速拔下胶梳，同时将加样孔中的气泡排干净。将玻璃板固定在电泳槽中，加入配置好的1×电泳液，内槽加满，外槽为内槽的一半即可。
3）加样：在加样孔中加入相同质量的蛋白样品和5 μL的Marker（用来指示蛋白大小）。
4）电泳：先在60 V条件下跑胶20 min，然后在100V条件下跑胶90 min，直至loading buffer跑到最底部。
3.3 转膜
1）配制转膜液：称取60 g的Tris 和288g的甘氨酸，加水定容到2L，充分搅拌溶解配制成10×转膜液，室温备用。使用时稀释至1×。稀释比例为：10×转膜液：甲醇：水=1:2:7。【注：转膜液要提前配制，在冰箱中冷却到4℃】
2）准备耗材：将PVDF浸泡在甲醇中适当的时间（0.5-1min），活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白质结合。
3）安装转膜夹板：取转膜夹，按照黑面-海绵-滤纸-电泳胶-PVDF膜-滤纸-海绵-白面的顺序依次放置后固定。要注意避免产生气泡，当有气泡时使用滚轮将气泡赶出。
4）安装转膜装置：将夹板放置在转膜槽中，注意按照正确的电极放置，在槽中放两个冰袋，加满1×转膜液。最后将整个转膜槽放置在冰里。
5）转膜：设定转膜条件：100 v、1 h。【注：可以根据蛋白的大小适当调整转膜的时间，蛋白分子量越小，转膜时间越短】
3.4 封闭
1）配制封闭液：对于磷酸化的蛋白使用5% BSA（溶剂为TBST），对于非磷酸化的蛋白使用5%的脱脂牛奶（溶剂为TBST）进行封闭。
2）封闭过程：将封闭液倒入合适大小的皿中，将PVDF放入皿中，注意封闭液要浸没PVDF膜，室温封闭1 h。
3）将膜取出，依据Marker显示和各目的蛋白大小，把膜切割成合适大小，标上序号。
3.5 孵育抗体
1）孵育一抗：将一抗（稀释后使用）倒入一抗孵育盒中，从封闭液中取出PVDF膜，用滤纸吸去残留液后，之后将对应的切割好的PVDF放入对应的抗体中，置于旋转摇床上4℃ 过夜。
2）漂洗：加入1× TBST漂洗，RT 3×10 min。
3）孵育二抗：将二抗（稀释后使用）加入孵育盒中，根据抗性的不同，将PVDF条带放到不同的二抗中，RT×1 h。
4）漂洗：加入1× TBST漂洗，RT 3 × 10 min。
3.6 显影
1）配制化学发光剂：将发光液试剂盒中的A液和B液等体积混合，摇匀后备用。
2）孵育发光剂：将PVDF膜依次放置在保鲜膜上铺展开，将配制好的发光剂快速均匀的加在膜上。常温避光反应3 min。
3）仪器发光。
Ref：
丁香通 https://www.biomart.cn/experiment/87.htm
百度文库https://wenku.baidu.com/view/9025e59ed4bbfd0a79563c1ec5da50e2534dd111.html
丁香园http://paper.dxy.cn/article/501051
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