化学发光免疫分析技术（CLIA-Chemiluminescence Immunoassay）

空白派

化学发光免疫分析是一种结合化学发光系统和免疫反应，通过化学反应产生光，以标记抗体来确定被分析物浓度的分析方法。因为它的分析灵敏度高,线性范围宽,没有散射光的干扰,没有放射性污染物, 设备简单等优势。因此被广泛应用于生命科学、临床诊断、环境监测、食品安全、药物分析等领域。
       下图显示的是在免疫诊断领域，化学发光免疫分析技术凭借其极高的灵敏度和高通量快速检测的技术性能，逐渐成为引领免疫诊断快速发展的主要动力。尽管化学发光免疫分析技术是几十年前开发的，但它目前仍然是分析化学的热门研究领域。近年来，许多研究人员一直热衷于使用新颖的材料和技术来增强化学发光免疫分析。比如说常规的化学发光具有信号弱，强度低和发光时间短的缺陷。那我们为了增强发光信号并延长发光时间，可以向系统中添加增强剂。增强剂通过促进电子活化而使得化学发光免疫分析的分析灵敏度显着提高。所以我们今天主要介绍几种用来提高化学发光效率和检测灵敏度的增强剂。



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1 Phenolic Compounds

       首先介绍酚类化合物用来做增强剂。以HRP催化的鲁米诺化学发光反应为例，其中HRP代表辣根过氧化物酶，这是一种常用酶。研究发现发现溴酚红在该反应中可以起到增强剂的作用，就是图中橙红色曲线。黑色曲线代表没有添加增强剂，蓝色曲线代表添加的是PIP，就是对碘酚，最受欢迎的增强剂之一。但是由于PIP难闻的气味，近年来它已被其他酚类化合物所取代。可以看到，在不存在溴酚红的情况下，这个系统显示出较低的化学发光强度。相反，添加溴酚红后，可以观察到快速而强烈的化学发光，表明溴酚红可大大增强该反应。



TALANTA. 2016,148, 246

       下图就是增强剂作用的机理。但是这一类的化学增强剂在实际应用中比较不稳定，并且背景干扰较大。



TALANTA. 2016,148, 246

2 Metal Nanoparticles (MNPs)

       接下来介绍金属纳米颗粒用做增强剂。目前最流行的金属纳米颗粒之一就是金纳米粒子。它不仅可以作为酶模拟物直接催化化学发光免疫分析反应，还可以装载大量的酶或其他分子来实现信号的放大。下图是金纳米颗粒功能化的方法和化学发光免疫分析的过程。在反应中，金纳米粒子可以促进自由基的产生，在其表面发生电子转移过程。



ANAL METHODS-UK. 2014,6, 5059

      下图比较了不同增强剂对免疫测定的影响，可以看出氯金酸相对于AgNO3，CoCl2和血红蛋白而言有着显著的增强作用。



ANAL METHODS-UK. 2014,6, 5059

       为了评估化学发光免疫分析的实际可行性，这篇文献将其分析参数与其他文献报道的化学发光免疫的分析参数进行比较。如表所示，用金纳米粒子作为增强剂的检测限是0.014ng/mL 是低于其他的增强剂，化学发光强度与抗原浓度的线性范围在0.12–30ng/mL。Au纳米粒子作为非酶增强剂可以提高灵敏度，并且避免了复杂的反应，从而使成本低廉，易于操作且节省时间。



ANAL METHODS-UK. 2014,6, 5059

2.3 Quantum Dots

       第三类是量子点(QDs)量子点作为增强剂，首先是分解H2O2生成自由基，然后通过能量转移和电子转移猝灭作用来促进化学发光。例如，下图在（亚硫酸氢钠）NaHSO3-H2O2体系中，ZnS量子点催化H2O2分解产生自由基，加速能量传递、电子猝灭，提高发光效率。



J PHYS CHEM C. 2016,120,9308

       下图，在Fe2+ –H2O2体系中，二硫化钼量子点促使H2O2在碱性条件下产生活性氧并诱导化学发光，显着增强了化学发光强度。但是与传统金属相比，基于量子点的增强型化学发光免疫分析技术存在潜在的毒性，费用也相对较高。



CHEM SCI. 2019,10,497

2.4 Carbon nanomaterials

       最后介绍的是碳纳米材料，它具有毒性低、环境友好、成本低，合成路线简单等优点。例如下面这篇文献合成了三种不同类型的吖啶酯(AE)功能化碳纳米材料，包括图中绿线代表的吖啶酯超功能化碳纳米颗粒(AE-cnps)，红线代表的吖啶酯超功能化氧化石墨烯(AE-go)和蓝线代表的吖啶酯超功能化多壁碳纳米管(AE-mcnts)。吖啶酯分子通过静电相互作用、π-π堆积相互作用和酰胺键组装在碳纳米材料的表面上。碳纳米材料可以有效地固定吖啶酯分子并促进羟基自由基和氧自由基的形成，导致强烈的发光。从右图可以看到，氧化石墨烯的化学发光强度最高，分别是碳纳米颗粒和碳纳米管的化学发光强度的8.7倍和3.7倍。这主要是由于不同碳纳米材料表面上吸附的吖啶酯分子数量不同所导致的。



ACS APPL MATER INTER . 2016,8, 17454

       虽然在化学发光免疫分析中引入碳纳米材料可以显著放大化学发光信号，但碳纳米材料的增强机理尚不清楚，甚至在某些情况下是矛盾的，因此有必要进行进一步的深入研究。
总结

       每种类型的增强剂都有其优点和缺点，还需要继续深入的研究。
Phenolic Compounds：比较不稳定，背景干扰较大
Metal Nanoparticles：金属纳米颗粒的物理特性与发光性能密切相关
Quantum Dots：具有潜在的毒性，费用相对较高
Carbon nanomaterials：增强机理尚不清楚

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