技巧篇 | 流式细胞术（FCM）

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FCM是利用流式细胞仪对处在快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分析技术。然而，在FCM的实际应用过程中，要想得到高质量的流式数据却并非易事。现就FCM实验中的常见问题进行分析，希望能帮助相关实验人员提高实验成功率。

1. 怎么选择合适的对照？
    1）同型对照：使用同型抗体做平行实验，主要目的是消除抗体与样本的非特异性结合。
    2）阴性细胞对照：使用已知的不表达目标抗原的细胞做平行实验，主要目的是消除抗体的非特异性结合。
    3）二抗对照：第二抗体多为荧光标记的多抗，非特异性结合一般较高，可能造成基础荧光值偏高，设立二抗对照平行实验的主要目的是消除二抗的非特异性荧光着色。
    4）阳性对照：一般会使用已知的高表达目标抗原的细胞做平行实验，主要目的是排除实验中实验方法、试剂、操作等实验的影响因素。
    5）空白对照：不进行任何标记的细胞，主要目的是用于测定基础荧光信号表达值。

2. 收集的细胞通过流式仪检测时，一般多少的细胞量合适？
    进行流式检测时，至少需要记录5000个活细胞，一般调整细胞密度至1*106/100ul进行流式检测。

3. FCM检测过程中如何设门（gating）？
    一般根据散射光进行设门，即我们通常所说的前散（forward scatter, FSC）和侧散（side scatter, SSC）来设门。FSC的大小与细胞的直径成正相关，不同的细胞，细胞越大，其FSC越大；反之越小。SSC的大小与细胞内颗粒结构的质量成正相关，不同的细胞，细胞内颗粒结构越复杂，质量越大，其SSC越大；反之越小。

4. FCM检测过程中如何调节补偿？
    在FCM检测过程中，如果存在多色，则必须进行荧光补偿调节。调节补偿首先要知道双阴性细胞的情况，其次，必须要用单阳和双阴性细胞。只有在有阴性细胞作为参照的情况下，才能既不会过多又不会过少地调节补偿。

5. FCM检测时，每次实验的细胞数一定要相同吗？
    FCM检测时，若不进行细胞计数而凭感觉随意进行实验会直接影响实验结果。当细胞量多而抗体量不变或细胞量不变而抗体量减少，那么荧光抗体平均分布到每个阳性细胞上的量就会相对减少。由此可见，不同的细胞量会影响最终的实验结果。因此，在准备样本时，必须进行细胞计数，使每个分组及每次实验的细胞数保持一致。

6. FCM检测时，如果存在多色分析，应该如何进行配色呢？
    在FCM检测过程中，如果存在多色分析，虽然可以通过荧光补偿来消除荧光光谱重叠的影响。但调节补偿过大在一定程度上仍然会影响测值的准确性，因此，我们一般建议尽量选择荧光光谱重叠少的荧光抗体组合。
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流式细胞学实验服务案例
周期检测：PI染色法检测检测药物、基因或蛋白等对细胞周期的影响。



凋亡检测：Annexin V/PI双染法检测药物、基因或蛋白对细胞凋亡及凋亡调控基因的影响



活性氧（ROS）检测：荧光染料DCFH-DA（2,7-Dichlorodi -hydrofluorescein diacetate）的荧光强度变化，定量检测细胞内活性氧水平



线粒体膜电位检测：阳离子荧光染料JC-1在细胞内以聚合体和单体两种不同的存在状态检测线粒体膜电位的变化。应用于细胞早期凋亡检测。



表面抗原检测/多指标流式检测：荧光标记的抗体来识别细胞表面的抗原，检测表面抗原的多少和种类。应用于细胞表型检测、细胞亚类检测、特定细胞群比例变化等。
小鼠肺部DC染色分析（CD45+F4/80-CD11chi I-AE+ viable cells）



胞内因子检测/多指标流式检测：
小鼠脾脏Treg染色分析（CD4+CD25+Foxp3+ viable cells）



磁珠分选：免疫磁珠分选，是基于抗原抗体特异性识别的原理，使用高度特异性单克隆抗体偶联的磁化微粒对目的细胞进行特异性的磁性标记。通过高强度、梯度磁场从而达到细胞磁性分离的目的。



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