干货分享！ELISA的基本原理及实验操作要点

生物科研实验室

一、ELISA基本原理
ELISA的核心原理在于，将抗原或抗体固定于固相载体表面，待测样本中的相应抗体或抗原会与之发生特异性结合。洗涤后，加入酶标记的抗原或抗体，形成免疫复合物。在底物存在下，酶催化底物产生颜色反应，从而进行检测。ELISA以其高灵敏度和特异性，能够检测到极低浓度（皮摩尔级别）的目标物。
二、ELISA实验方法
ELISA根据设计不同，可分为直接法、间接法、夹心法和竞争法四种。
  1. 直接ELISA：将抗原直接固定于固相载体上，洗涤后加入酶联检测抗体，酶催化底物产生与抗原量成正比的显色信号。此方法快速简便，但由于仅使用一种抗体，特异性相对较低，背景信号可能较高（见图2：直接ELISA示意）。
  2. 间接ELISA：抗原固定于固相载体上，洗涤后加入一抗，再次洗涤后加入酶联二抗。酶催化底物产生与抗原量成正比的显色信号。此方法通过二抗放大信号，特异性较直接ELISA好，但二抗可能引起交叉反应。
  3. 夹心ELISA：最常用的ELISA类型。使用两种特异性抗体夹住抗原，称为匹配抗体对。捕获抗体固定于固相载体上，加入样本，目标抗原被捕获。洗涤后加入酶联检测抗体，酶催化底物产生与目标抗原量成正比的显色信号。此方法高度特异性，适用于复杂样本中的抗原浓度检测，但操作相对繁琐。
  4. 竞争性ELISA：捕获抗体固定于固相载体上，加入酶联抗原与样本中的目标抗原竞争性与捕获抗体结合。样本中目标抗原越多，酶联抗原结合越少。酶催化底物产生的信号与目标抗原量成反比。此方法适用于小分子和激素的浓度测定，特异性相对较低。
三、ELISA操作关键要点
  1. 材料选择：ELISA实验中，材料选择至关重要。试剂如稀释液、包被液、缓冲液和显色液等需注意使用期限。稀释液、缓冲液和包被液配制后不宜久置，显色液需现配现用。选择质量优良的酶标板和检测试剂，并严格遵循产品说明书操作。
  2. 加样准确性：使用微量加样器加样，确保加样量准确，加在板孔底部，避免加在孔壁或溅出，防止气泡产生。更换吸头以避免交叉污染。加显色液时，最好使用多道微量加样器，统一加样时间，减小误差。
  3. 稀释精确性：血清样本、抗原和抗体需准确稀释。可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样，确保加样器、吸头和容器一致。稀释后振荡1分钟以保证混合均匀。
  4. 孵育条件：孵育温度一般为37℃或4℃。37℃孵育时，酶标盒可置于传热性能良好的湿盒内，或用细胞培养板盖子盖住酶标板，避免重叠放置。4℃孵育时，将酶标板包好置于冰箱内。孵育时间要适宜，过长可能导至非特异性吸附。
  5. 洗涤过程：洗涤旨在去除未结合的物质、游离酶标记物和非特异性吸附的干扰物质。洗涤应彻底，可采用多次洗涤或在洗液中添加Tween-20。洗板时要充分拍板，直至孔内无明显残留液体。
  6. 显色反应：显色是ELISA的最后一步反应，酶催化底物产生颜色反应。反应温度和时间对显色效果至关重要。定量测定时，应严格控制加入底物后的反应温度和时间。定性检测时，可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显**况，适当调整反应时间。常用显色剂为OPD和TMB。
  7. 读板操作：比色前用洁净的吸水纸擦干液体，减少干扰。将板正确放入酶标仪中，酶标仪需置于避光环境中，室温控制在15-30℃，使用前预热15-30分钟，以确保结果稳定.