流式细胞术-小鼠各器官单细胞悬液制备（肝脏篇）

青草

流式技术已经是很多实验室常用的实验方法了。除了染色上机检测以外，前期的准备工作，尤其是单细胞悬液的制备尤为重要。
那么小鼠不同组织器官该怎么摘取，又该怎么制备单细胞悬液呢？接下来将定期更新不同器官组织的单细胞悬液制备方式，欢迎大家一起讨论交流。
1、 处死：通过二氧化碳窒息法，处死实验小鼠。通过注射器针头将小鼠固定在解剖台面上，腹部朝上，用酒精喷壶对小鼠全身打湿消毒。
2、 灌流：打开小鼠腹腔和胸腔。用注射器针头小心将小鼠的右心房上面的心包挑破，从小鼠左心室缓慢灌入 10 ml 预冷的 PBS 缓冲液，进行心脏体循环灌流，以此来减少所取器官中残留的血液。心脏灌流后，迅速将小鼠心脏取出（弯头镊夹紧根部，直接摘取），避免残留的血液回流。
3、 摘取器官：用弯头镊子先将胆囊摘除（在肝叶交界处，弯头镊夹紧底部，快速摘除），再将小鼠肝脏摘下置于 RPMI 1640 完全培养基中。
4、 研磨组织：将肝脏取出后放置在过滤网中，过滤网内事先放入一定量的 RPMI 1640 完全培养基，用 5 ml 注射器尾部小心碾压肝脏，使组织能够穿过
过滤网进入 6 cm 培养皿中，反复碾压直至肝脏充分研磨干净。
5、 离心：将处理好的肝脏组织转移到 15 ml Corning 管中，离心（ 4 ℃ ， 50g， 1min），舍弃沉淀，将上清转移至新的 15 ml Corning 管中，添加RPMI 1640 完全培养基至14ml，再次离心（ 4 ℃ ， 50g， 1min），舍弃沉淀，将上清转移至新的 15 ml Corning 管中，再次离心（ 4 ℃ ，500 g， 6min）后，倒弃上清，置于冰上待用。
6、 密度梯度离心：然后用 4ml 40 % percoll 分离液重新悬起细胞，之后将细胞悬液小心缓慢铺到4ml 70 % percoll分离液上面（贴壁添加，勿扰动交界层）。将离心机的升降速均调到最低，进行离心（ 15 ℃ ， 750 g， 22 min）。离心结束后，将悬浮在 40 %和 70 % percoll 分离液中间的细胞层小心吸出，得到的细胞即为肝脏组织中的白细胞。
7、 裂红过滤：将此细胞悬液用预冷的 FACS 细胞表面染色缓冲液（ PBS + 0.1% BSA）中和后离心（ 4 ℃ ，500 g， 6min），弃上清后，用 1 ml ACK
红细胞裂解液重悬后置于冰上 3 min 进行裂红处理。随后用预冷的 FACS 细胞表面染色缓冲液（ PBS + 0.1% BSA）中和反应并离心（ 4 ℃ ， 500 g， 6 min），弃上清。最后用 RPMI 1640 完全培养基将细胞悬起，滤膜过滤至新的 15 ml Corning管中管中定容，并稀释计数后置于冰上备用
以上就是小鼠肝脏单细胞悬液的制备方法。如有疑问，欢迎在评论区提出。

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